劉昌利，何曉梅，李 剛，張麗君

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.安徽省植物細(xì)胞工程技術(shù)中心，安徽 六安 237012)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)作為國(guó)家一級(jí)保護(hù)植物和安徽省名貴的道地藥材[1，2]，教學(xué)和研究中多是臘葉標(biāo)本。由于臘葉標(biāo)本失水失色后不能很好保持植物的原生態(tài)形狀和色澤，無(wú)鮮活感，且標(biāo)本脆薄易破損、易氧化變色、不利于長(zhǎng)期保存。植物塑化技術(shù)利用聚乙二醇置換生物組織中的水分[3]，既能保持植物原有的狀態(tài)，也可以延長(zhǎng)標(biāo)本的使用壽命。且塑化試劑價(jià)廉易得，標(biāo)本制作方法簡(jiǎn)單易行，制成的標(biāo)本無(wú)毒無(wú)味經(jīng)久耐用。為使石斛標(biāo)本具有更為逼真的中藥色澤特征，以滿足教學(xué)、科研和科普宣傳需要。本試驗(yàn)基于植物固色和塑化技術(shù)[4，5]，探討霍山石斛的固色和塑化工藝，建立了霍山石斛標(biāo)本的制作新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

霍山石斛采自皖西學(xué)院石斛栽培標(biāo)準(zhǔn)化示范基地。硫酸銅(上海龍昕化工有限公司，分析級(jí)AR)、醋酸銅(天津市興復(fù)精細(xì)化工研究所， AR)、氯化亞錫和甲醛(無(wú)錫市展望化工試劑有限公司，AR)、無(wú)水乙醇(上海振興化工一廠，AR)、丙三醇(西隴化工股份有限公司，AR)、蜂蠟(天津市大茂化學(xué)試劑廠，AR)、聚乙二醇(PEG)200與聚乙二醇(PEG)400(天津博迪化工股份有限公司，AR)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本采集

采集霍山石斛，修剪去爛葉、黃葉及部分小枝，保持植株完整，洗凈石斛根部，用蒸餾水沖洗晾干備用。采集正常生活狀態(tài)、開(kāi)花或結(jié)有果實(shí)的霍山石斛植株，以制作生活史不同階段的標(biāo)本。

1.2.2 標(biāo)本固色

霍山石斛的根白色，莖、葉和果實(shí)呈綠色，花黃色。為保持標(biāo)本不同部位的顏色，選擇0%、1%、3%、5%、7%的氯化亞錫溶液對(duì)石斛根固色[3，4]，固色30 min，每5 min觀察1次。莖、葉和果實(shí)的固色選擇硫酸銅和醋酸銅溶液[4]，將準(zhǔn)備好的標(biāo)本分成2組，分別置于0%、3.5%、5%、7%、10%、14%的硫酸銅溶液，0%、5%、7%、10%、14%、20%濃度的醋酸銅溶液中，均固定4 d，期間每6～8 h觀察1次，當(dāng)石斛植株由綠色變?yōu)辄S色再由黃色變成綠色為止，取出完成固色步驟的標(biāo)本洗凈晾干備用。完成石斛植株根莖葉和果實(shí)部分的固色后，僅將石斛花小心浸入花朵專用固色液中固色。本實(shí)驗(yàn)以7%、10%的硫酸銅，10%、14%的醋酸銅，5%、7%的氯化亞錫溶液分別作為花的固色液對(duì)花固色4 d，實(shí)驗(yàn)中第1 d每3～6 h觀察一次，第2～4 d每6 h觀察1次，僅記錄有變化的時(shí)間點(diǎn)[4，6]。為更好保護(hù)石斛花的顏色，在莖葉、果實(shí)固色中對(duì)有花的石斛植株不要將花浸入硫酸銅或醋酸銅固色液中，在花柄處拴上細(xì)線，將花朵懸掛固定在根、莖葉(果實(shí))所用固定液液面上，動(dòng)作輕柔避免損傷石斛花。為方便操作標(biāo)本的固色順序是依次花、根、莖葉和果實(shí)。

1.2.3 標(biāo)本塑化

將固色處理好的標(biāo)本置于無(wú)水乙醇中浸泡3 h進(jìn)行脫水，脫水完成后分成A、B兩組再分別進(jìn)行塑化，塑化液的配置與塑化步驟見(jiàn)表1[7]，A組隨著聚乙二醇分子量和濃度的增加，塑化時(shí)間逐步延長(zhǎng)，B組塑化時(shí)間基本不變。對(duì)完成塑化后的標(biāo)本進(jìn)行簡(jiǎn)單的姿態(tài)整理后放入真空干燥箱(40 ℃)干燥24 h，然后將完全干燥的標(biāo)本接受陽(yáng)光照射3個(gè)月(6～8月)，通過(guò)觀察標(biāo)本的顏色變化以比較A、B兩組方法抗紫外線損傷及光氧化能力的大小。干燥好的塑化標(biāo)本存放于標(biāo)本瓶中用蜂蠟密封后避光保存即可。

表1 標(biāo)本的塑化操作

注：保存液即醋酸銅結(jié)晶加入50%冰醋酸溶液中，配制成的飽和溶液。

2 結(jié)果

2.1 霍山石斛根的固色效果

氯化亞錫對(duì)石斛根的固色速度很快，1%濃度組對(duì)根的固色5 min內(nèi)即可完成，且隨時(shí)間延長(zhǎng)1%氯化亞錫處理的根顏色基本無(wú)變化，但外觀上標(biāo)本根的白色度不如3%、5%和7%氯化亞錫的固色效果好，綜合考慮采用7%氯化亞錫固色5 min效果更好見(jiàn)表2。

表2 不同濃度氯化亞錫溶液對(duì)根的固色效果

2.2 霍山石斛莖葉與果實(shí)的固色效果

不同濃度硫酸銅、醋酸銅溶液固色石斛標(biāo)本4 d，結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)石斛莖葉和果實(shí)固色效果較好的固色液是7%和10%硫酸銅溶液，14%和20%的醋酸銅溶液，固色時(shí)間2～3 d。由于第4 d沒(méi)有變化故在表中不再記錄。

表3 硫酸銅溶液對(duì)莖葉的固色效果

2.3 霍山石斛花的固色效果

硫酸銅(7%、10%)、醋酸銅(10%、14%)和氯化亞錫(5%、7%)溶液對(duì)花的固色實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5顯示，7%氯化亞錫、10%醋酸銅和7%硫酸銅溶液對(duì)花的固色效果較好，其他組的固色效果較差。具體固色效果是：7%氯化亞錫>10%醋酸銅>7%硫酸銅，固色時(shí)間3～6 h為宜。

2.4 標(biāo)本的塑化效果

A組標(biāo)本石斛莖葉綠色，但莖缺少生活狀態(tài)的透明感，葉片有皺縮現(xiàn)象；B組標(biāo)本顏色自然，葉片舒展無(wú)脫落，莖綠色略有透明感，與生活狀態(tài)的石斛幾乎沒(méi)有差別，B組的塑化效果好于A組。將塑化好的A、B兩組標(biāo)本、固色后沒(méi)有塑化的標(biāo)本和新鮮石斛各選5株裸露放置在室內(nèi)朝南的窗戶下暴曬3個(gè)月，如表6所示。3個(gè)月后A組標(biāo)本褪色，B組標(biāo)本顏色基本無(wú)變化。

表4 醋酸銅溶液對(duì)莖葉的固色效果

表5 三種溶液對(duì)石斛花的固色效果

表6 光照對(duì)標(biāo)本的影響

3 討論

對(duì)比植物傳統(tǒng)的臘葉標(biāo)本、浸制標(biāo)本，植物塑化標(biāo)本是一種新的標(biāo)本類型，它是在新鮮植物進(jìn)行固色處理的基礎(chǔ)上，用聚乙二醇替代石斛標(biāo)本體內(nèi)的水分并達(dá)到防腐固定的作用[3，8]。

塑化標(biāo)本制作中固色液的選擇非常重要，它直接影響到塑化后標(biāo)本顏色是否生動(dòng)逼真。綠色植物標(biāo)本固色液一般都是用硫酸銅或者醋酸銅，通過(guò)Cu2+離子將葉綠素中Mg2+置換出來(lái)，由于進(jìn)入葉綠素分子中的Cu2+穩(wěn)定，所以固色后標(biāo)本的顏色穩(wěn)定，以后無(wú)論是制作臘葉標(biāo)本、浸制標(biāo)本還是塑化標(biāo)本，只要保管得當(dāng)其顏色可長(zhǎng)久保持、不易褪色[4，8]。

以硫酸銅、醋酸銅溶液固色石斛標(biāo)本實(shí)驗(yàn)中標(biāo)本顏色由綠變黃，是葉綠素中Mg2+被交換出來(lái)、再由黃變綠，是Cu2+逐步進(jìn)入葉綠素分子的核心結(jié)構(gòu)中替換Mg2+ [4，9]。當(dāng)銅離子完全替換鎂離子后石斛呈綠色，完成了標(biāo)本的固色。實(shí)驗(yàn)中莖葉的固色時(shí)間2～3 d，與車前草的固色時(shí)間相同，如要縮短固色時(shí)間可嘗試進(jìn)行水浴加熱[10]。

本實(shí)驗(yàn)采用7%和10%硫酸銅溶液，14%和20%的醋酸銅溶液對(duì)標(biāo)本莖、葉和果實(shí)固色的效果差別不大，但鑒于后續(xù)塑化中要用到冰醋酸，建議采用醋酸銅溶液固色。這是因?yàn)榱蛩徙~中的硫酸根與冰醋酸結(jié)合，溶液酸性增強(qiáng)，植物體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)易受破壞，塑化后標(biāo)本易褪色變黃，從而影響顏色的穩(wěn)定和塑化效果[6]。

現(xiàn)有報(bào)道中對(duì)植物的黃花多是采用50%醋酸加熱至顏色不再變化后取出[8，11]。本實(shí)驗(yàn)嘗試50%醋酸加熱固色標(biāo)本，但霍山石斛花小，花瓣薄，出現(xiàn)花朵被燙熟萎蔫的現(xiàn)象，效果不好。從方便對(duì)石斛根莖葉、果實(shí)的整體固色角度出發(fā)，比較了硫酸銅、醋酸銅、氯化亞錫溶液對(duì)花的固色效果，結(jié)果顯示固色效果是7%氯化亞錫>10%醋酸銅>7%硫酸銅，這3組總體差別不大，但它們對(duì)黃花的固色原理并不清楚。

植物白色部分的固色通常使用亞硫酸溶液浸泡[4]，但考慮到亞硫酸溶液固色時(shí)間長(zhǎng)，且固色后取出的標(biāo)本需要日光下長(zhǎng)時(shí)間暴曬，標(biāo)本在變白的同時(shí)也受到很大的傷害[8]。由于石斛人工栽培基質(zhì)含大量樹皮，石斛根部呈深褐色，試驗(yàn)中也是偶然將石斛根部放于固色花的氯化亞錫中，發(fā)現(xiàn)氯化亞錫對(duì)根的固色速度快效果好，但其機(jī)理尚不清楚。

聚乙二醇(PEG)是一種水溶性高分子化合物，它所呈現(xiàn)的形態(tài)與分子量大小密切相關(guān)，當(dāng)分子量200～700時(shí)表現(xiàn)為無(wú)色通明的液體狀態(tài)，分子量1000～2000時(shí)為白色蠟質(zhì)半固體。本試驗(yàn)參考李紫薇、陸海峰等人報(bào)道，實(shí)驗(yàn)中僅選用了分子量200和400的聚乙二醇[3，7]，而張宏意報(bào)道在小草本、亞灌木、灌木和喬木等綠色植物塑化中以分子量600的聚乙二醇效果最好[6]，雖然霍山石斛屬蘭科植物較灌木柔弱纖細(xì)，但后續(xù)如開(kāi)展相關(guān)研究應(yīng)將聚乙二醇的分子量設(shè)定在200～700[3]。

本方法的不足之處在于標(biāo)本的制作時(shí)間偏長(zhǎng)，約7～8 d，后續(xù)試驗(yàn)建議固色階段通過(guò)水浴加熱縮短固色時(shí)間[10]，并通過(guò)嘗試提高聚乙二醇的分子量，增大聚乙二醇濃度來(lái)改進(jìn)塑化液配方縮短塑化時(shí)間[3]。

綜上可見(jiàn)石斛花和根均選用7%氯化亞錫分別固色5 min和3～6 h；莖葉和果實(shí)固色液選用14%和20%的醋酸銅溶液均可，固色時(shí)間2～3 d。塑化以分子量400的聚乙二醇為主，延長(zhǎng)20%、60%聚乙二醇(分子量200)和60%聚乙二醇(分子量400)替換水分子的時(shí)間至12 h塑化效果更好。