張麗平， 汪文君， 李 智， 許超艷， 姜安杰， 彭 學(xué)

(江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇徐州 221116)

對羥基苯甲酸(4-hydroxybenzoic acid，4HBA)酯類是一種廣譜且高效的抑菌劑，在pH值3～8內(nèi)都能夠有效地抑制微生物的生長，4HBA酯類都具有酚羥基結(jié)構(gòu)，同苯甲酸、山梨酸相比，其抗菌性較強(qiáng)且安全性高，由此被廣泛應(yīng)用于食品和藥品領(lǐng)域[1]。4HBA酯類包括4HBA甲酯、4HBA乙酯、4HBA丙酯、4HBA丁酯、4HBA辛酯等。盡管4HBA酯類被認(rèn)為是比較安全高效的防腐劑，但因其大量使用造成的危害也越來越引起人們的重視。4HBA酯類在食品、藥品、化妝品中的過量添加對人體產(chǎn)生了一定的毒性[2]，輕者造成人體腸胃不適，經(jīng)皮膚粘膜吸收導(dǎo)致發(fā)炎癥狀，重者則會因其中的雌性激素造成雌性荷爾蒙升高，是男性不育的誘因，嚴(yán)重危害人體健康[3]。4HBA酯類排放到空氣或水體中，也造成了環(huán)境污染，潛在地威脅著人類的健康[4-5]。4HBA甲酯作為4HBA酯類的一種，同樣廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。4HBA甲酯的殺菌效果較低，一般與4HBA丙酯一同使用來提高其防腐抗菌效果。4HBA甲酯的抑菌效果受溶液的pH值影響較大，酸性的環(huán)境更有利于其防腐作用[6]。但若遇到明膠蛋白質(zhì)、甲基纖維素等高分子化合物，其防腐效果會被抑制。4HBA甲酯除了用作防腐殺菌劑，同時還用于有機(jī)合成的護(hù)腐添加劑。

隨著4HBA甲酯的大量使用與排放，對環(huán)境和人體的危害也越來越受到人們的關(guān)注，探索出一條安全且高效的降解4HBA甲酯的途徑至關(guān)重要。在外界環(huán)境中，目前4HBA酯類的降解方式有臭氧處理、光催化、光降解、紫外光解和物理吸附等，但這些方法都不能完全除去4HBA酯類，在空氣和環(huán)境水體中還有一定的殘留，降解效果并不理想[7]。在人體胃腸道內(nèi)，4HBA甲酯的代謝方式和去路也有待進(jìn)一步探索[8]。從浙江海底泥沙中分離出來的B1菌株具有降解4HBA甲酯的能力，降解效率高，且B1菌株易于培養(yǎng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海底泥沙取自浙江近海。所用試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 人工海水培養(yǎng)基：ONR7a[9]。

MB液體培養(yǎng)基(1 L)：Marine Broth 37.4 g，蒸餾水溶解后定容至1 L，高壓蒸汽滅菌15 min。

唯一碳源培養(yǎng)基(0.05%)：4HBA甲酯、4HBA乙酯、4HBA丙酯、4HBA丁酯各11.6 g，95%乙醇溶解并定容至 10 mL，制備成5%碳源濃縮液。200 mL海水培養(yǎng)基中加入 2 mL 碳源濃縮液，分別制備成4HBA甲酯、4HBA乙酯、4HBA丙酯、4HBA丁酯培養(yǎng)基。

50×TAE(100 mL)緩沖液：24.2 g Tris、3.72 g Na2EDTA·2H2O、5.71 mL的冰醋酸，pH 值8.2～8.5，備用。

1×TAE緩沖液(100 mL)：50×TAE稀釋使用。

1%瓊脂糖凝膠：1 g瓊脂糖溶于100 mL 1×TAE緩沖液，加熱溶解。

1.2.2 菌種的分離 采用涂布平板法進(jìn)行初篩，劃線法進(jìn)行復(fù)篩，最后用40%甘油和單一菌種1 ∶1保存，儲存在-80 ℃冰箱中。

1.2.3 革蘭氏染色 以大腸桿菌(G-菌)為對照，對B1菌種進(jìn)行染色觀察，整個染色過程包括涂片、初染、媒染、脫色、復(fù)染、鏡檢等。

1.2.4 B1菌株的最適溫度 挑取單菌落B1，預(yù)培養(yǎng)后離心，加入少量4HBA甲酯培養(yǎng)基混勻制備成菌液濃縮液，取等量加入到其他4HBA甲酯液體培養(yǎng)基中，每組3個平行，分別放在20、25、30、35、40、45 ℃搖床中培養(yǎng)18 h，測定吸光度D600 nm值，繪制該菌種的最適溫度曲線。

1.2.5 B1菌株的最適pH值 取等量菌液濃縮液分別加入到不同pH值的4HBA甲酯液體培養(yǎng)基中，pH值梯度為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0。每組3個平行，30 ℃搖床中培養(yǎng)18 h，測定吸光度D600 nm值，繪制該菌種的最適pH值生長曲線。

1.2.6 B1菌株的生理生化反應(yīng) 吸取5 μL菌液濃縮液滴在生化反應(yīng)管內(nèi)，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察生化反應(yīng)管內(nèi)培養(yǎng)液的顏色變化情況。

1.2.7 菌種鑒定 試劑盒提取B1全基因組：新鮮菌液離心濃縮，加入200 μL GA、20 μL Proteinase K、220 μL GB混合均勻，70 ℃水浴10 min；再加入220 μL無水乙醇，混合后轉(zhuǎn)移至收集管中，離心，棄廢液；使用600 μL PW清洗2次，離心棄廢液，室溫靜置；使用TE將吸附柱上的DNA洗脫后保存。

B1菌株的16S rDNA PCR：在PCR反應(yīng)管中加入超純水27.8 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP Mix 5 μL、MgCl24 μL、Primer1(27F)3 μL、Primer2(1 492R)3 μL、模板DNA 2 μL、Tag DNA polymerase 0.2 μL混合均勻。反應(yīng)管放入PCR儀中，設(shè)置程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃保溫10 min。

核酸電泳：1.2%瓊脂糖溶膠液，加入2% GoldenView混勻，倒入膠板冷卻凝固；裝膠后將Marker、DNA樣品(與溴酚藍(lán)染液混合均勻后)上樣；接上電源，設(shè)置電泳條件，當(dāng)溴酚藍(lán)跑到距末端1 cm左右結(jié)束電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描和拍照，觀察結(jié)果。

測序：取PCR擴(kuò)增獲得的16S rDNA 30 μL，濃度>50 ng/μL ，送到生工生物工程(上海)股份有限公司測序部進(jìn)行測序，得到測序結(jié)果。

繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹：根據(jù)測序的結(jié)果找出與該菌株相似度較高的其他菌株，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，深入了解該菌株。

1.2.8 采用HPLC檢測B1菌株對4HBA甲酯的降解率 由于利用唯一碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)該菌株生長比較慢，而且濃度比較低，先用MB培養(yǎng)基培養(yǎng)，至其濃度到D600 nm為0.5，離心，洗滌后轉(zhuǎn)移至唯一碳源培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每2 h取1次樣，采用HPLC記錄培養(yǎng)基中4HBA甲酯的降解情況。

1.2.9 B1菌株對其他4HBA酯類的降解情況 將降解4HBA甲酯的B1菌株，分別接種在4HBA甲酯、4HBA乙酯、4HBA丙酯、4HBA丁酯的固體和液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 d，觀察該菌的生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 B1菌株的菌落形態(tài)

利用含0.05% 4HBA甲酯的海水培養(yǎng)基，以海底泥沙作為樣品，在液體培養(yǎng)中多次富集培養(yǎng)后，經(jīng)過多次劃線培養(yǎng)篩選出B1菌株，該菌株在固體平板上的菌落形態(tài)見圖1。B1菌株的菌落形態(tài)為乳白色不透明，邊緣整齊，外觀濕潤，表面光滑略凸起。

2.2 B1菌株的革蘭氏染色

經(jīng)過革蘭氏染色后，B1菌株被染成紅色(圖2)，故該菌為革蘭氏陰性菌。

2.3 B1菌株的最適溫度

根據(jù)不同培養(yǎng)溫度下B1菌液的濃度繪制出最適溫度曲線，從圖3中可知，在25～37 ℃ B1菌株生長良好，30 ℃時菌液濃度最高，即B1菌株的最適生長溫度為30 ℃。

2.4 B1菌株的最適pH值

由圖4可知，在不同pH值海水培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)18 h后測定菌液濃度，pH值在7.0～7.5時B1菌株生長速度較快。

2.5 B1菌株的生理生化反應(yīng)

將B1菌株接種在含不同物質(zhì)的生化管中，30 ℃培養(yǎng)后觀察管內(nèi)顏色變化情況。由表1可知，在檢測的各種物質(zhì)中，B1菌株可以利用絕大多數(shù)的糖類、氨基酸等物質(zhì)，但是不能利用硫化氫和尿素。

表1 B1菌種對各種物質(zhì)的利用情況

2.6 B1菌株的16S rDNA電泳結(jié)果

以B1菌株的濃縮液為模板，擴(kuò)增所使用的引物是27F、1 492R，16S rDNA片段大小為1 500 bp，條帶明亮單一(圖5)，可直接進(jìn)行測序。

2.7 B1菌株的測序結(jié)果及系統(tǒng)進(jìn)化樹

將B1菌株送到測序公司得到測序結(jié)果并提交到數(shù)據(jù)庫中，獲得的編碼為KY941134。根據(jù)測序結(jié)果，利用MEGA繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)。由圖6可知，B1菌株和Bacillustimonensis的相似度最高，為99.5%。B.timonensis是從人體腸道中分離出來的是一種革蘭氏陰性厭氧菌，屬棒狀桿菌屬，是人類腸道中最大的屬之一，但是目前沒有關(guān)于該菌株降解4HBA酯類的報道。

2.8 利用HPLC檢測B1菌株對4HBA甲酯的降解情況

從圖7可以看出，B1菌株能夠?qū)?HBA甲酯分解為4HBA和相應(yīng)的醇類物質(zhì)，12 h左右4HBA甲酯被降解完全。

2.9 B1菌株對其他4HBA酯類的降解情況

將B1菌株分別接種在含4HBA甲酯、4HBA乙酯、4HBA丙酯、4HBA丁酯的固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)一段時間，觀察菌落生長情況。從圖8中可以看出，B1菌株不僅能在4HBA甲酯的唯一培養(yǎng)基上生長，還能在4HBA乙酯、4HBA丙酯上生長，但是在4HBA丁酯上不能生長，其具體的降解規(guī)律有待進(jìn)一步研究。

3 討論

從浙江海底泥沙篩選出的B1菌株可以有效地降解4HBA甲酯，同時也發(fā)現(xiàn)它有降解4HBA乙酯、4HBA丙酯的能力。在這些4HBA酯類中，B1菌株對4HBA甲酯的降解率最高。

4HBA酯類因常被用作防腐劑而被人體大量攝入，威脅人體健康。4HBA酯類在人體內(nèi)積累后降解規(guī)律及其代謝去向還尚未知曉[10]。通過本研究可以初步獲悉人體腸道微生物具有降解4HBA酯類的能力，為研究4HBA酯類在人體內(nèi)的降解機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ)。同時，對B1菌株的深入探究，有助于將其開發(fā)為降解環(huán)境中4HBA酯類的工業(yè)菌株，緩解由于4HBA酯類的大量應(yīng)用造成的水體和環(huán)境污染。但此次研究只是初步了解此菌株，并未深入全面地認(rèn)識到其降解規(guī)律，還未探究其中的關(guān)鍵基因，未掌握B1菌株的降解譜，所以后面的工作還有很多， 對于B1菌株的進(jìn)一步研究將會有趣而艱巨，值得深入探索。