楊 玉 孫 煜 孫寶盛 朱 倩 張俊珍 高鵬飛

(山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801)

硒被認為是飼糧中必需的營養(yǎng)成分已有40余年。傳統(tǒng)的補硒方法是在飼糧中添加亞硒酸鈉作為硒源添加劑，但亞硒酸鈉存在毒性強、使用不安全、生物利用率較低、環(huán)境污染大、具有氧化作用等問題，許多國家已規(guī)定飼料中禁止使用無機硒。有機硒在動物體內(nèi)具有吸收率高、生物活性強、毒性低、環(huán)境污染小等特點[1]。缺硒可導致克山病、癌癥、白內(nèi)障、心血管與抑郁癥等疾病發(fā)生，所以富硒雞蛋已成為補硒的重要媒介。研究表明，添加富硒益生菌能顯著提高蛋雞的產(chǎn)蛋率、日產(chǎn)蛋量和蛋重，降低料蛋比，而添加無機硒對這些指標均無顯著影響[2]。添加酵母硒和富硒苜蓿能顯著提高羅曼蛋雞的產(chǎn)蛋率，而添加亞硒酸鈉對其產(chǎn)蛋率沒有顯著影響[3]，硒源和水平對蛋雞血液硒含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和總抗氧化能力(T-AOC)有顯著影響，有機硒較無機硒更易于沉積在雞蛋、肝臟和肌肉等組織中[4-7]，顯著提高雞蛋中硒含量[8-10]和GSH-Px活性[11-12]。添加硒后，雞蛋的哈氏單位(評價蛋新鮮度的重要指標之一)下降幅度降低，其中添加有機硒減緩哈氏單位下降的效果優(yōu)于無機硒[2]。趙玉鑫[13]研究表明，飼糧中添加亞硒酸鈉后，對蛋雞血清膽固醇和甘油三酯含量無顯著影響，但有降低趨勢。王澤明[14]研究表明，飼糧中添加不同硒源對蛋雞血漿膽固醇和甘油三酯含量無顯著影響。而Attia等[9]研究表明，添加有機硒和無機硒及其互作可顯著降低血漿膽固醇含量，增加蛋黃硒含量，其中以0.4 mg/kg有機硒組效果最佳。硒對雞生產(chǎn)性能、抗氧化功能、血漿膽固醇含量等方面的研究已有報道，但其結(jié)果不一，分子機理方面的研究甚少。鑒于此，本試驗通過在飼糧中添加不同水平的酵母硒，探討其對產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、抗氧化與脂代謝及其相關(guān)基因表達的影響，并對其分子機理做初步探討，旨在確定其適宜添加水平，為合理利用酵母硒、提高蛋硒含量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用酵母硒(selenium yeast，SY)購自奧特奇生物有限公司，硒含量2 000 mg/kg。

1.2 試驗時間與地點

試驗于2015年6月11日至2015年8月21日在山西省大同市大同縣建鑫養(yǎng)殖場和山西農(nóng)業(yè)大學動物遺傳育種與動物營養(yǎng)省級重點實驗室進行。

1.3 試驗設(shè)計

試驗選用69周齡、健康的海蘭褐蛋雞432只，隨機分成4組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)18只。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧(含0.2 mg/kg亞硒酸鈉，以硒計)，試驗組在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上分別添加0.2、0.6和1.0 mg/kg(以硒計)酵母硒。預(yù)試期2周，期間對照組與試驗組的產(chǎn)蛋率和蛋重均無顯著差異(P>0.05)，隨后開始正式試驗，正試期8周?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗雞采用立體3層籠養(yǎng)，每籠3只，雞只自由采食與飲水，自然光照并補充人工光照到16 h；溫度(20±2) ℃，相對濕度50%～60%，自然通風結(jié)合縱向負壓通風；其他均按養(yǎng)殖場常規(guī)程序進行。

1.5 樣品采集與測定

1.5.1 生產(chǎn)性能

試驗期間每日記錄各重復(fù)的產(chǎn)蛋數(shù)、產(chǎn)蛋總重量，每7 d結(jié)料1次，記錄各重復(fù)耗料重，計算平均日采食量，然后以重復(fù)為單位統(tǒng)計產(chǎn)蛋率、平均蛋重和料蛋比。

1.5.2 蛋品質(zhì)

試驗第14、28、42、56天，每個重復(fù)隨機抽取3枚雞蛋測定蛋重、蛋形指數(shù)、蛋殼強度、蛋白高度、哈氏單位、蛋黃顏色、蛋殼厚度，取其平均值。

1.5.3 血漿及組織相關(guān)指標

試驗結(jié)束時每重復(fù)隨機選取1只健康狀況良好且體重接近的蛋雞，空腹翅靜脈采血5 mL，3 500 r/min離心10 min制備血漿，分裝后于-20 ℃保存。隨后頸靜脈放血致死，采用無菌操作迅速取出肝臟放入液氮中，置于-80 ℃待測。按照相應(yīng)試劑盒測定血漿GSH-Px活性、T-AOC、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性與丙二醛(MDA)、膽固醇、甘油三酯含量以及肝臟GSH-Px活性與膽固醇和甘油三酯含量，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.5.4 蛋黃相關(guān)指標

試驗結(jié)束時每重復(fù)選取2枚雞蛋稱重，破殼后分離蛋清和蛋黃，使用氫化物發(fā)生原子熒光分析方法測定蛋黃硒含量；使用相應(yīng)試劑盒測定蛋黃膽固醇和甘油三酯含量，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1)每千克維生素預(yù)混料含有Contained the following per kg of vitamin premix: 維生素A乙酸脂 retinol acetate 51 000 000 IU，VD313 500 000 IU，DL-α-生育酚乙酸酯DL-α-tocopheryl acetate 50 000 mg，VK35 000 mg，VB15 000 mg，VB225 000 mg，VB614 000 mg，VB1265 mg，葉酸 folic acid 4 000 mg，煙酰胺nicotinamide 90 000 mg，D-泛酸鈣D-calcium pantothnate 32 000 mg，D-生物素D-biotin 100 mg。2)每千克微量元素預(yù)混料含有Contained the following per kg of trace mineral premix：Mn (as manganese sulfate) 60 g，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 60 g，Cu (as copper sulfate) 8 g，Se (as sodium selenite) 100 mg，Zn (as zinc sulfate) 60g，I (as potassium iodide) 130 mg。3)計算值 Calculated values。

1.5.5 肝臟RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol法提取肝臟組織RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳、核酸蛋白儀測定RNA完整性、濃度和純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.6 引物設(shè)計

根據(jù)測序數(shù)據(jù)庫中谷胱甘肽過氧化物酶1(GPx1)、膽固醇7α-羥化酶(Cyp7a1)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合酶1c(SREBP-1c)、硫氧還蛋白還原酶1(Trxr1)、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)基因的序列，設(shè)計其引物，由北京華大基因研究中心合成。引物序列見表2。

1.5.7 實時熒光定量PCR

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示，用Duncan氏法比較組間差異顯著性，采用LSD法對差異顯著的數(shù)據(jù)進行極顯著差異比較，并對相應(yīng)的數(shù)據(jù)進行線性和二次曲線回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧中添加酵母硒對產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能的影響

由表3可知，與對照組相比，飼糧中添加0.2、0.6和1.0 mg/kg的酵母硒顯著提高了產(chǎn)蛋率(P<0.05)，并顯著降低了料蛋比(P<0.05)，但對平均蛋重無顯著影響(P>0.05)；飼糧中添加0.2 mg/kg的酵母硒顯著增加了平均日采食量(P<0.05)。產(chǎn)蛋率、平均蛋重和平均日采食量各試驗組之間均無顯著差異(P>0.05)，但0.6 mg/kg組的料蛋比顯著低于0.2和1.0 mg/kg組(P<0.05)。

表2 引物序列

表3 飼糧中添加酵母硒對產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能的影響

(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。表5、表6和表7同。In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), while with no or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 5, Table 6 and Table 7.

2.2 飼糧中添加酵母硒對產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)的影響

由表4可知，與對照相比，飼糧中添加1.0 mg/kg的酵母硒顯著提高了第14天的蛋白高度(P<0.05)；飼糧中添加0.2 mg/kg的酵母硒顯著增加了第14天的蛋黃顏色(P<0.05)；飼糧中添加0.6 mg/kg的酵母硒極顯著提高了第42天的蛋殼強度(P<0.01)，添加1.0 mg/kg的酵母硒顯著提高了第42天的蛋殼強度(P<0.05)；飼糧中添加0.6和1.0 mg/kg的酵母硒顯著增加了第42天的蛋殼厚度(P<0.05)。隨著飼糧中酵母硒添加量的增加，蛋黃硒含量極顯著提高(P<0.01)。

2.3 飼糧中添加酵母硒對產(chǎn)蛋后期蛋雞抗氧化指標的影響

由表5可知,與對照組相比，飼糧中添加0.2 mg/kg的酵母硒極顯著提高了血漿T-SOD活性(P<0.01)，顯著降低了血漿MDA含量(P<0.05)，而對血漿GSH-Px活性、T-AOC及肝臟GSH-Px活性無顯著影響(P>0.05)；飼糧中添加0.6 mg/kg的酵母硒極顯著提高了血漿GSH-Px、T-SOD活性和T-AOC及肝臟GSH-Px活性(P<0.01)，顯著降低了血漿MDA含量(P<0.05)；飼糧中添加1.0 mg/kg的酵母硒極顯著提高了血漿GSH-Px、T-SOD及肝臟GSH-Px活性(P<0.01)，顯著提高了血漿T-AOC (P<0.05)，并極顯著降低了MDA的含量(P<0.01)。

表4 飼糧中添加酵母硒對產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), while with no or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

表5 飼糧中添加酵母硒對產(chǎn)蛋后期蛋雞抗氧化指標的影響

2.4 飼糧中添加酵母硒對產(chǎn)蛋后期蛋雞脂代謝指標的影響

由表6可知，與對照組相比，飼糧中添加0.2、0.6和1.0 mg/kg的酵母硒對血漿膽固醇和甘油三酯含量均無顯著影響(P> 0.05)；飼糧中添加1.0 mg/kg的酵母硒極顯著降低了肝臟甘油三酯含量(P<0.01)，顯著降低了肝臟膽固醇含量(P<0.05)；飼糧中添加0.6 mg/kg的酵母硒顯著降低了肝臟膽固醇含量(P<0.05)；飼糧中添加 0.2 mg/kg的酵母硒對肝臟膽固醇和甘油三酯含量均無顯著影響(P> 0.05)；飼糧中添加0.6、1.0 mg/kg的酵母硒顯著降低了蛋黃甘油三酯含量(P<0.05)，而對蛋黃膽固醇含量無顯著影響(P>0.05)。3個試驗組間，0.6和1.0 mg/kg組的肝臟膽固醇和蛋黃甘油三酯含量均顯著低于0.2 mg/kg(P<0.05)，且1.0 mg/kg組的甘油三酯含量還極顯著低于0.2和0.6 mg/kg組(P<0.01)。

表6 飼糧中添加酵母硒對產(chǎn)蛋后期蛋雞脂代謝指標的影響

2.5 飼糧中添加酵母硒對產(chǎn)蛋后期蛋雞肝臟抗氧化、脂代謝相關(guān)基因mRNA相對表達量的影響

由表7可知，與對照組相比，飼糧中添加0.6 mg/kg的酵母硒極顯著提高了肝臟GPx1、Trxr1、SREBP-1cmRNA的相對表達量(P<0.01)，極顯著降低了HMGCRmRNA的相對表達量(P<0.01)，而對Cyp7a1 mRNA的相對表達量無顯著影響(P>0.05)。

表7 飼糧中添加酵母硒對產(chǎn)蛋后期蛋雞肝臟抗氧化、脂代謝相關(guān)基因mRNA相對表達量的影響

2.6 模型估測產(chǎn)蛋后期蛋雞對酵母硒的需要量

回歸分析表明，蛋黃硒含量、血漿GSH-Px活性、T-AOC、T-SOD活性、MDA含量及肝臟GSH-Px活性均隨酵母硒添加量的增加呈顯著的二次曲線變化(表8)。就生產(chǎn)性能而言，酵母硒的適宜添加量為0.60～0.65 mg/kg；就蛋黃硒含量而言，酵母硒的適宜添加量為2.25 mg/kg；就血漿GSH-Px活性、T-AOC、T-SOD活性及肝臟GSH-Px活性而言，酵母硒的適宜添加量為0.67～0.77 mg/kg。

3 討 論

3.1 飼糧中添加酵母硒對產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能的影響

有關(guān)硒對蛋雞生產(chǎn)性能的研究結(jié)果各異。胡華鋒等[3]研究發(fā)現(xiàn)，添加酵母硒和富硒苜蓿能顯著提高羅曼蛋雞的產(chǎn)蛋率，而添加亞硒酸鈉對其產(chǎn)蛋率沒有顯著影響；Gjorgovska等[15]研究表明，飼糧中添加酵母硒能改善蛋雞的生產(chǎn)性能；Pavlovic等[16]發(fā)現(xiàn)酵母硒可以使蛋雞的產(chǎn)蛋量顯著提高；而孫慶艷等[11]和Delezie等[17]研究表明，添加不同的硒源和硒水平對蛋雞的生產(chǎn)性能并無顯著影響。本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加不同水平酵母硒后產(chǎn)蛋率均顯著升高，料蛋比均顯著降低，與Gjorgovska等[16]選用80周齡蛋雞所得結(jié)果一致，說明添加酵母硒可改善產(chǎn)蛋后期蛋雞機體的硒代謝，影響促性腺激素釋放，提高產(chǎn)蛋率。

表8 蛋雞相關(guān)指標與酵母硒需要量的回歸模型

3.2 飼糧中添加酵母硒對產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)的影響

蛋品質(zhì)主要通過蛋殼厚度、蛋殼強度、蛋形指數(shù)、蛋白高度、哈氏單位和蛋黃顏色等指標來綜合判斷。蛋殼強度和蛋殼厚度直接影響雞蛋的破損率，哈氏單位直接反映雞蛋新鮮程度及蛋白品質(zhì)。

研究表明，飼糧中添加酵母硒對蛋殼厚度的影響不顯著[18]；夏季在飼糧中添加酵母硒，蛋殼厚度、蛋白高度和哈氏單位均顯著提高[19]；添加酵母硒可提高蛋殼重與蛋殼強度[20]。而Pavlovic等[16]研究表明，飼糧中添加酵母硒對蛋殼品質(zhì)、蛋殼厚度、蛋殼強度和蛋形指數(shù)均無顯著影響。本試驗結(jié)果顯示，飼糧中添加0.6 mg/kg的酵母硒可顯著提高6周末的蛋殼強度和蛋殼厚度，與Invernizzi等[20]所得結(jié)果一致。其原因可能是蛋雞采食酵母硒后體內(nèi)硒易沉積于蛋殼膜和蛋殼中，具體機理有待進一步研究。

3.3 飼糧中添加酵母硒對產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋黃硒、膽固醇和甘油三酯含量的影響

Han等[12]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，補硒顯著提高了蛋中硒的含量。Bennett等[21]也發(fā)現(xiàn)，在飼糧硒添加量在一定范圍內(nèi)時，蛋硒含量會隨硒添加量的增加而增加，其中有機硒效果優(yōu)于無機硒。Paton[22]得出飼糧硒含量與蛋硒含量基本呈正相關(guān)。本試驗中蛋黃硒含量隨飼糧中酵母硒添加量的增加而增加，所得結(jié)果與Paton[22]的研究結(jié)果相符。

關(guān)于酵母硒對蛋黃膽固醇和甘油三酯含量影響的研究較少。本試驗中，飼糧中添加酵母硒有降低蛋黃膽固醇含量的趨勢，但效果不顯著；飼糧中添加0.6、1.0 mg/kg的酵母硒可顯著降低蛋黃甘油三酯含量，這與李靜等[23]的研究結(jié)果不符。李靜等[23]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加酵母硒能降低蛋雞蛋黃中膽固醇含量，其主要原因可能是升高了蛋雞血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量，降低了極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)含量所致，具體機制有待進一步研究。

3.4 飼糧中添加酵母硒對產(chǎn)蛋后期蛋雞抗氧化及其相關(guān)基因表達的影響

GSH-Px和T-SOD作為機體抗氧化體系的重要酶，在抗氧化過程中發(fā)揮重要作用。其中GSH-Px的活性中心為硒代半胱氨酸，由4個含硒代半胱氨酸亞基組成，所以機體硒水平直接反映GSH-Px活性。研究表明，飼糧中添加硒可顯著提高母雞血清GSH-Px活性[12]；飼糧中添加0.3 mg/kg酵母硒可顯著提高肉鵝血清中GSH-Px和T-SOD活性，同時MDA含量顯著降低[24]；在飼糧中添加利用啤酒廢酵母制備得到的酵母硒，肉雞肝臟GSH-Px活性可隨酵母硒添加量的增加而升高[25]。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加適量的酵母硒可顯著或極顯著提高蛋雞血漿GSH-Px、SOD活性，T-AOC與肝臟GSH-Px活性，并顯著或極顯著降低血漿MDA含量，與上述研究結(jié)論相符，且隨著酵母硒添加量的增加抗氧化性能呈先上升后下降的趨勢，以添加0.6 mg/kg酵母硒時血漿GSH-Px、T-SOD活性，T-AOC和肝臟GSH-Px活性達到峰值。雖然在添加1.0 mg/kg酵母硒時較添加0.6 mg/kg酵母硒時抗氧化性能整體有所降低，但與對照組相比，1.0 mg/kg組上述指標仍顯著或極顯著高于對照組，說明酵母硒添加量在1.0 mg/kg范圍內(nèi)均可提高機體抗氧化性能，但以添加0.6 mg/kg酵母硒時最好。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在GSH-Px中，GPx-1在肝臟中活性最高，是細胞中含量最豐富的硒蛋白；Trxr1也是衡量機體抗氧化功能的重要指標之一，其活性也主要受機體硒含量的影響，但飼糧中添加硒源及硒水平對GPx1和Trxr1表達量的影響說法不一。為了進一步探討酵母硒抗氧化的分子機制，本試驗測定了飼糧中添加0.6 mg/kg酵母硒對蛋雞肝臟GPx1和Trxr1 mRNA相對表達量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼糧中添加0.6 mg/kg可極顯著提高蛋雞肝臟GPx1和Trxr1 mRNA的相對表達量。高建忠[26]在仔豬飼糧中添加亞硒酸鈉和富硒益生菌后發(fā)現(xiàn)，二者對仔豬肝臟GPx1 mRNA相對表達量的影響不顯著；缺硒可造成大鼠肝臟GPx1 mRNA相對表達量降低，補硒可提高大鼠肝臟GPx1 mRNA相對表達量[27]。Lu等[28]的研究表明，隨著機體硒含量的升高，Trxr1和Trxr2蛋白表達量增加，缺硒使大鼠肝臟Trxr1 mRNA表達量下降為正常大鼠的15%，而GSH-PxmRNA表達量僅下降了正常大鼠的2%，而本試驗在正常飼糧中添加0.6 mg/kg酵母硒，蛋雞肝臟Trxr1 mRNA相對表達量的提高幅度也高于GPx1 mRNA，說明Trxr1 mRNA受硒狀態(tài)調(diào)節(jié)幅度高于GPx1 mRNA[29]。

3.5 飼糧中添加酵母硒對產(chǎn)蛋后期蛋雞脂代謝的影響

肝臟是合成蛋雞體內(nèi)膽固醇的主要器官，當體內(nèi)膽固醇含量較高時，SREBP-1c可促進脂肪酸生成并與膽固醇合成膽固醇酯，從而消耗膽固醇[30]，而HMGCR是膽固醇合成過程中的限速酶[31-33]。

關(guān)于硒對蛋雞血液、肝臟膽固醇和甘油三酯含量影響的研究很少，趙玉鑫[12]研究表明，飼糧中添加亞硒酸鈉后蛋雞血清膽固醇和甘油三酯含量與對照組相比差異不顯著，但有降低趨勢。李靜等[23]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.5 mg/kg富硒酵母對蛋雞血清膽固醇和甘油三酯含量的影響不顯著。王澤明[14]也指出，飼糧中添加不同硒源對蛋雞血漿膽固醇和甘油三酯含量無顯著影響。本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加酵母硒對蛋雞血漿膽固醇和甘油三酯含量無顯著影響，與上述研究結(jié)果一致。但飼糧中添加0.6 和1.0 mg/kg酵母硒可顯著降低蛋雞肝臟膽固醇含量，添加1.0 mg/kg酵母硒可極顯著降低蛋雞肝臟甘油三酯含量，添加0.6 mg/kg酵母硒可極顯著提高肝臟SREBP-1cmRNA相對表達量，極顯著降低蛋雞肝臟HMGCRmRNA相對表達量，這與肝臟膽固醇和甘油三酯含量減少的結(jié)果相吻合，可見酵母硒可通過影響SREBP-1c和HMGCRmRNA的表達來影響機體脂代謝。

4 結(jié) 論

飼糧中添加酵母硒可提高產(chǎn)蛋后期蛋雞的生產(chǎn)性能、蛋殼強度、蛋黃硒含量，改善機體抗氧化性能和膽固醇代謝能力。通過回歸分析得出，以飼糧(含0.20 mg/kg亞硒酸鈉形式的硒)中添加0.60～0.77 mg/kg酵母硒的效果較好。