耿樹香，寧德魯，陳海云，賀娜，李勇杰

(云南省林業(yè)科學院,云南 昆明 650201)

核桃(JuglansregiaL.)青皮是核桃和胡桃楸的未成熟外果皮，為民間常用中藥，又稱為青龍衣,約占整個果實的60%[1]。核桃果實采收后，青皮被當做垃圾廢棄，沒有加以利用，然而青皮中含有多種有效成分，如利用得當，可變廢為寶。核桃青皮含有多種活性成分，相對含量較高的為多酚類和醌類化合物[2-3]，核桃青皮中的胡桃醌屬萘醌類化合物，是核桃青皮中主要活性成分，對許多病菌均有抑制作用，還被用于治療癌癥。新鮮山核桃(Caryacathayensis)青皮中胡桃醌含量較高，達到0.42%，隨著存儲時間的延長，胡桃醌含量逐漸減少，存儲9年的青皮中只含有0.09%。因此，須對新鮮青皮及時加工，實現(xiàn)胡桃醌的有效利用[4]。按照新鮮核桃青皮中含0.4%計算，每噸青皮可得4kg胡桃醌，目前市場上含量10%的胡桃醌價格在98元/kg左右，則每噸青皮可獲利近4 000元。植物單寧，是一種高度聚合的多酚化合物，多酚的抗氧化功能可以對慢性病起到預防作用。核桃青皮中的單寧是水解類，含量在4%左右。能夠?qū)PPH·(二苯代苦味?；杂苫?表現(xiàn)出一定的清除能力，具有好的抗氧化活性和抑菌效果[5-6]。核桃青皮中含有的另一主要功能成分為黃酮，Talapatra S K等[7]對黃酮類化合物進行提取分離研究發(fā)現(xiàn)：核桃青皮中的黃酮類化合物多具有易溶于極性較大的有機溶劑和堿性溶液，游離的酚羥基，黃酮甙的形式存在，少數(shù)以黃酮甙元的形式存在。目前研究發(fā)現(xiàn)的核桃青皮中的主要黃酮類化合物包括金絲桃苷、櫻花亭、胡桃苷等[8]。

核桃青皮中含有的大量多酚、黃酮、鞣質(zhì)類化合物在人體內(nèi)具有清除氧自由基功效，從而減少疾病發(fā)生或延緩衰老[9]。本研究系統(tǒng)測定了國內(nèi)核桃主栽品種青皮中的3種主要活性成分胡桃醌、黃酮及單寧含量，并作綜合評價，為核桃青皮的進一步深加工利用奠定一定的理論基礎。

1 試驗材料及方法

1.1 試驗材料

供試的40個核桃試樣的成熟果實于2015年8月15日至9月30日采自云南、陜西、山西、新疆、四川、河北6個主栽區(qū)，每一品種摘取4個方位各10個成熟果混合后手工剝下青皮，直接進行青皮樣預處理。采樣品種及地點見表1。

1.2 試劑及儀器

儀器設備 U-5100UV/VIS可見紫外分光光度計(日本日立)，HPLC液相色譜儀(美國賽默飛)，AE-100電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器)，恒溫水浴鍋，離心機(移液管5mL、吸耳球、研缽2個)。

試劑 福林酚試劑、無水碳酸鈉、沒食子酸、丙酮、甲醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、碳酸鈉、氫氧化鈉均為分析純(購自天津化學試劑廠)，蘆丁標準品，胡桃醌標準品(購自國家標準物質(zhì)中心)。

1.3 試驗及分析方法

1.3.1 黃酮的測定

(1)標準曲線繪制 精密稱取蘆丁標準品12.5mg，置于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配成蘆丁標準母液。分別取0、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL母液于另一個25mL容量瓶中，加蒸餾水至8mL，加入5%的亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻后靜置6min，再加入10%的硝酸鋁溶液1mL，搖勻后靜置6min，最后加入4%的氫氧化鈉溶液10mL，用蒸餾水定容，搖勻靜置15min，待檢測。

測定波長的選擇用配制的標準工作液在200-600nm波長范圍內(nèi)進行紫外可見掃描，以甲醇空白作對照。濃度梯度結果表明：蘆丁在510nm處有最大吸收峰，故選取510nm作為檢測波長。

(2)樣品 稱取約0.5g核桃青皮樣品(已脫脂)于50mL離心管中，加入甲醇30mL，再超聲提取30min，取出后快速冷卻至室溫，甲醇定容至50mL。取1mL再定容至20mL。

精確吸取樣液1mL于25mL容量瓶中，加5% NaNO2溶液1mL搖勻，放置5min，再準確加入10% Al(NO3)3溶液1mL搖勻，放置6min，然后加入5mL 4%NaOH溶液，最后用30%甲醇稀釋到刻度，于溫水浴中加熱10min，取出，同時作試劑空白，以試劑空白為對照，于蘆丁最大吸光值處測定吸光度A，查標準曲線，即得所取樣液中黃酮含量。

(3)樣品中黃酮含量計算方法 樣品中黃酮含量(以蘆丁計)( % ) =CV1/WV2，式中，C為樣液含黃酮量(mg)，V1為定容體積(mL)，V2為顯色反應測定取用樣液體積(mL),W為稱樣量(g)。

1.3.2 單寧的測定

福林酚 用前稀釋5倍備用。

75g/L碳酸鈉溶液 稱取37.5g無水碳酸鈉溶于250mL溫水中，混勻，冷卻，稀釋至500mL，過濾到儲備瓶中備用。

60%丙酮溶液 用水稀釋。

沒食子酸標準儲備液 準確稱取0.110 0g水合沒食子酸，溶解并定容至100mL，此溶液沒食子酸質(zhì)量濃度為1 000mg/L。冰箱冷藏可保存5d。

表1 樣品名與來源地

沒食子酸標準使用液 分別吸取1 000mg/L沒食子酸標準儲備液0.0、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL和5.0mL至100mL容量瓶中，定容，溶解質(zhì)量濃度為0.0、10.0mg/L、20.0mg/L、30.0mg/L、40.0mg/L和50.0mg/L。

操作步驟如下。

(1)樣品預處理 樣品解凍后，搗碎，稱取約2g搗碎樣品，加入濃度為60%的丙酮溶液，料液比1︰10(g/mL)超聲波輔助提取1h，冷卻后定容至40mL。取提取液10 000r/min離心3min，上清液備用。

(2)標準曲線繪制 吸取0.00、10.0mg/L、20.0mg/L、30.0mg/L、40.0mg/L和50.0mg/L沒食子酸標準使用液各1.0mL，分別加5.0mL的水，1.0mL稀釋的福林酚溶液和3.0mL碳酸鈉溶液，混勻，放置2h，以標準曲線0.0mg/L為空白，在765nm波長下測定標準溶液的吸光度，以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

(3)樣品測定 吸取1.0mL樣品提取液，分別加入5.0mL水，1.0mL稀釋的福林酚溶液和3.0mL碳酸鈉溶液，顯色，放置2h，以不加樣品提取液為空白，在765nm波長下測定樣品溶液的吸光度。

1.3.3 胡桃醌含量測定

標準溶液配制 精密稱取2.0mg胡桃醌標準品，用甲醇超聲溶解，配制成2mg/mL的標準母液，然后用甲醇稀釋成梯度濃度為1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的工作使用液，過0.45μm濾膜待上機分析。

色譜條件 色譜柱溫30℃，紫外波長250nm，進樣量10μL，采集時間10min。

樣品分析 取剪碎混合樣品約5g，置于研缽中加入約2mL 75%甲醇溶液，研磨后置于25mL具塞試管中定容至25mL，超聲30min，冷卻后補足至刻度。取適量樣液4 000r/min離心10min，取上清液過0.45μm濾膜于進樣小瓶中，待測。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2007和SPSS 18.0分析軟件，對所有核桃品種青皮3個活性成分進行分析，并進行綜合評價。

2 結果與分析

2.1 不同主栽核桃品種青皮成分分析

22個不同地區(qū)核桃品種青皮營養(yǎng)成分檢測結果顯示(表2)，黃酮含量最高的為魯?shù)榇舐?號核桃(24.776mg/g)，最低的為元源早(14.429mg/g)，平均值為18.713mg/g，檢測的10個云南核桃品種中有8個超過平均值，12個普通核桃品種中僅有2個超過平均值；單寧含量最高的為漾濞泡核桃(13.485mg/g)，最低的為元源早(14.429mg/g)，平均值為11.335mg/g，檢測的10個云南核桃品種中有8個超過平均值，12個普通核桃品種中有7個超過平均值；胡桃醌含量最高的為大姚三臺核桃(0.23mg/g)，最低的為遼核1號(0.001 4mg/g)，平均值為0.050mg/g，檢測的10個云南核桃品種中有1個超過平均值，12個普通核桃品種中有5個超過平均值。

在對22個不同核桃品種青皮的比較中發(fā)現(xiàn)，青皮功能成分的黃酮含量云南核桃有80%的超過平均值，高于普通核桃的33.33%，單寧含量云南核桃有80%的超過平均值，高于普通核桃的58.33%。

表2 不同主栽核桃品種青皮中黃酮、單寧及胡桃醌含量

圖1 不同地區(qū)主栽核桃品種青皮功能成分測定結果

2.2 不同區(qū)域漾濞泡核桃青皮成分分析

8個不同地區(qū)漾濞泡核桃的青皮營養(yǎng)成分檢測結果見表3。

表3 8個不同地區(qū)漾濞泡核桃青皮的功能成分

由表3可知，黃酮含量范圍在16.892-19.904mg/g之間，最高的為普洱景東地區(qū)的漾濞泡核桃，最低的為臨滄雙江地區(qū)的漾濞泡核桃，平均值為18.136mg/g，變異系數(shù)為6.14%；單寧含量范圍在10.927-16.847mg/g，最高的是大理永平地區(qū)的漾濞泡核桃，最低的是臨滄鳳慶縣的漾濞泡核桃，平均值為13.810mg/g，變異系數(shù)為16.69%；胡桃醌含量范圍在0.008-0.081mg/g，最高的是普洱景東的漾濞泡核桃，最低的是大理永平的漾濞泡核桃，平均值為0.040mg/g，變異系數(shù)為68.61%。這3個營養(yǎng)成分變異系數(shù)值均不大，說明這3個指標的遺傳變異不大，相對穩(wěn)定，數(shù)值的大小不會因為環(huán)境的改變而發(fā)生太大變化。

2.3 不同海拔漾濞泡核桃青皮功能成分分析

5個不同海拔漾濞泡核桃青皮營養(yǎng)成分測定結果顯示(表4)，黃酮含量為16.110-30.807mg/g，含量最高的為海拔2 563m處核桃樣，含量最低是海拔1 734m核桃樣，平均含量為20.260mg/g；單寧含量為5.483-13.485mg/g，含量最高的為海拔1 904m處核桃樣，含量最低的為海拔2 300m處核桃樣，平均含量為10.130mg/g；胡桃醌含量為0.001 3-0.060 0mg/g，含量最高的為海拔2 162m處核桃樣，含量最低的為海拔2 300m處核桃樣，平均含量為0.0300mg/g。

表4 不同海拔‘漾濞泡核桃’青皮功能成分表

2.4 雜交核桃云新系列青皮成分分析

7個云新系列核桃品種青皮測定結果中見表5。

表5 云新系列青皮成分

由表5可知，黃酮含量為17.710-20.392mg/g，含量最高的為云新云林，含量最低的為云新301，平均含量為18.961mg/g；單寧含量為11.485-17.268mg/g，含量最高的為云新306，含量最低的為云新64，平均含量為14.726mg/g；胡桃醌含量為0.011 3-0.097 4mg/g，含量最高的為云新306，含量最低的為云新云林，平均含量為0.055 8mg/g。

2.5 不同主產(chǎn)區(qū)核桃青皮成分分析

以云南的10個品種、新疆的1個品種、陜西的4個品種、河北的3個品種、山西的3個品種和四川的1個品種6個不同主產(chǎn)區(qū)的部分優(yōu)良品種為研究對象，對其青皮功能成分進行測定，取其平均值，進行綜合分析比較，得出最優(yōu)的核桃青皮品種。

6個不同產(chǎn)區(qū)核桃青皮營養(yǎng)成分測定結果顯示(圖2)，黃酮含量最高的云南地區(qū)的平均含量20.198mg/g，含量最低是四川地區(qū)的(14.429mg/g)，除云南外其它5省區(qū)平均含量為17.713mg/g；單寧含量最高的是山西的(12.636mg/g)，含量最低的是四川的(5.391mg/g)，平均含量為10.318mg/g；胡桃醌含量最高的是山西的(0.097mg/g)，含量最低的為新疆的(0.015mg/g)，平均含量為0.044mg/g。

圖2 不同產(chǎn)區(qū)核桃青皮功能成分圖

2.6 不同種核桃青皮成分分析

以普通核桃的12個品種、云南核桃的10個品種、云新系列雜交核桃的7個品種共3個核桃種為研究對象，對其青皮、仁、分心木的營養(yǎng)成分進行測定，取其平均值，并以SPSS進行分析比較，找出綜合品質(zhì)最優(yōu)的種。

3個不同種的核桃青皮營養(yǎng)成分測定結果顯示(表6)，黃酮含量最高的是云南核桃(20.198mg/g)，含量最低的是普通核桃(17.475mg/g)；單寧含量最高的雜交核桃(14.727mg/g)，含量最低的是普通核桃(10.585mg/g)；胡桃醌含量最高的是普通核桃和雜交核桃(0.056mg/g)，含量最低的是云南核桃(0.042mg/g)。核桃青皮中黃酮、單寧、胡桃醌含量的變異系數(shù)均較小，說明這3個營養(yǎng)成分遺傳穩(wěn)定性好，不會隨環(huán)境變化而產(chǎn)生變異。

在對3個不同種核桃青皮、仁和分心木的比較中發(fā)現(xiàn)，青皮黃酮含量最高的云南核桃，含量最低是普通核桃，單寧含量最高的雜交核桃，含量最低的是普通核桃，胡桃醌含量普通核桃和雜交核桃一樣高，含量最低的是云南核桃。

表6 3個不同種青皮的功能成分比較

3 結論與討論

核桃青皮含有多種次生物質(zhì)，包括酚類、黃酮類、香豆素、萜類、甾類和有機酸等，也是生產(chǎn)天然色素的良好資源。核桃采收后脫掉的核桃青皮、核桃殼等的量巨大，其中僅少數(shù)作為藥用，大多數(shù)均廢棄或者作為燃料使用。核桃青皮、分心木作為核桃生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，一直沒有得到充分的開發(fā)與利用。在提倡環(huán)保以及提高附加值的角度上，如何消化這些曾經(jīng)的“垃圾”，使其發(fā)揮更大的應用價值，可從充分對核桃有效成分進行分析并根據(jù)需要對其加以綜合利用著手，將豐富的自然資源優(yōu)勢轉(zhuǎn)化為經(jīng)濟優(yōu)勢，使經(jīng)濟效益、社會效益、環(huán)境效益達到最大化。

目前針對核桃青皮研究最為廣泛的有兩個方向。其一是根據(jù)核桃青皮具有染色性能的特點，對其主要著色成分和上色機制作深入的研究，開發(fā)核桃青皮在化妝品、食品和染織的市場價值。天然色素使用安全，且有一定的營養(yǎng)價值和藥理保健作用，因此開發(fā)天然色素，符合保障人們的健康及食品工業(yè)的快速發(fā)展的要求。以核桃青皮為原料可得到安全無毒的天然色素，且色素附著能力較強、原料獲得豐富，還能實現(xiàn)資源的綜合利用，同時生產(chǎn)工藝簡單、產(chǎn)率高、成本低、安全無毒。該色素不僅適用食品，還用于染發(fā)劑生產(chǎn)等多個領域，因此核桃青皮中提取的色素有很好的開發(fā)應用價值。其二是進一步研究其藥用活性成分和作用機理，充分發(fā)揮核桃青皮的藥用價值及植物源性生物防治劑。醌類化合物是核桃青皮發(fā)揮其抑菌、殺菌、殺蟲等作用的主要有效物質(zhì)之一。對云南主栽核桃品種青皮中胡桃醌的含量進行檢測分析，結果表明，青皮中臨滄鳳慶縣漾泡、麗江古城區(qū)漾泡、普洱景東漾泡、迪慶漾泡、海拔1 902m處漾泡共5個核桃試樣的胡桃醌含量較高，適用于醌類物質(zhì)的提取或作為農(nóng)藥生物制劑加工。而昌寧細香、大姚三臺、娘青、華寧大砂殼、魯?shù)榇舐?號、魯?shù)榇舐?號、普洱景東漾泡、臨滄云縣漾泡以及海拔2 300m和海拔2 563m處漾泡的核桃青皮中黃酮含量尤為豐富，可適用于青皮中黃酮組分的制備提取。此外，單寧作為一個多元酚類物質(zhì)，其在食品、化工加工以及醫(yī)藥等方面具有廣泛的應用。華寧大白殼、圓菠蘿、永11、麗江古城區(qū)漾泡、臨滄雙江漾泡、大理永平漾泡、臨滄云縣漾泡、大理漾濞漾泡、海拔1 902m漾泡、海拔2 162m漾泡核桃品種青皮中單寧含量較高，可用于單寧物質(zhì)的提取制備及相關產(chǎn)品的加工。