余 婷，韓亞非

（1．邯鄲市中醫(yī)院內(nèi)科，邯鄲 056001；2．邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)外四科，邯鄲 056001）

細(xì)胞凋亡是缺血性腦病神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的主要形式，是缺血性腦損傷的主要病理機(jī)制之一[1－2]，而海馬區(qū)神經(jīng)元是對(duì)腦組織缺血缺氧最為敏感的部位?？鄥⑺厥侵兴幙鄥⒌闹饕行С煞种?，既往研究發(fā)現(xiàn)苦參素能夠通過抑制細(xì)胞凋亡而對(duì)心肌缺血、肝臟缺血起到一定的保護(hù)作用[3－4]，本實(shí)驗(yàn)制備慢性腦缺血大鼠模型并給予苦參素，探討苦參素通過抑制大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡而對(duì)慢性腦缺血損傷起到一定的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠（雌雄不限）購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（冀）2013－1－003]，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑 苦參素購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司（批號(hào)：20170114）；末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：170324）；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－3（Caspase－3）多克隆抗體、核因子－κB（NF－κB）多克隆抗體、B 淋巴細(xì)胞瘤－2（Bcl－2）多克隆抗體、Bcl－2 相關(guān) X 蛋白（Bax）多克隆抗體和ABC－DAB試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：201701009、201703012、201703029、201702001、201704006）；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所（批號(hào)：20170309、20170413、20170114）；白介素－1β（IL－1β）、白介素－6（IL－6）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：170129、170312、170116）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組與模型制備 取100只實(shí)驗(yàn)用大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和苦參素低[25 mg/（kg·d）]、中[50 mg/（kg·d）]、高[100 mg/（kg·d）]劑量組，每組20只。采用結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈制備慢性腦缺血大鼠模型，假手術(shù)組行手術(shù)操作但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。術(shù)后第2天開始腹腔注射給藥治療（每日1次），療程7 d[5]。

1.3.2 觀察大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)及凋亡狀況 每組隨機(jī)取10只大鼠，實(shí)施深度麻醉后斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，多聚甲醛溶液（濃度4%）固定3 d、石蠟包埋、切片、脫蠟水化，然后行常規(guī)蘇木精－伊紅（HE）染色后通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)（海馬CA1區(qū)范圍見圖1）；行TUNEL染色后觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡狀況并計(jì)算凋亡指數(shù)（AI），AI（%）=（視野凋亡細(xì)胞數(shù)/視野細(xì)胞總數(shù)）×100%，每只取5張切片，每張切片取5個(gè)互不重疊的視野，取平均值。

圖1 大鼠大腦海馬組織結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Brain hippocampustissue structure of rats

1.3.3 檢測(cè)海馬區(qū) Bcl－2、Bax蛋白表達(dá) 取 1．3．2制備的大鼠腦組織石蠟切片，脫蠟水化處理后，通過ABC－DAB法進(jìn)行染色：乙醇梯度脫蠟水化、磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌、3%過氧化氫－甲醇溶液孵育25 min、PBS 洗滌、山羊血清封閉 1．5 h、滴加一抗4℃過夜、PBS洗滌、滴加二抗室溫孵育1．5 h、PBS洗滌、滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素室溫孵育1 h、PBS洗滌、DAB顯色5 min、充分水洗、梯度脫水、封片，然后通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察并照相保存。每只大鼠取5張切片、每張圖片同一部位選取互不重疊的5個(gè)視野，采用Image Pro plus圖像分析系統(tǒng)測(cè)定圖片灰度并半定量分析海馬區(qū)Bcl－2、Bax蛋白表達(dá)。

1.3.4 檢測(cè)海馬組織 Caspase－3、NF－κB蛋白表達(dá) 取每組剩余的10只大鼠，實(shí)施麻醉后斷頭取腦并剝?nèi)『ｑR組織，研磨勻漿、經(jīng)12 000 r/min低溫（4℃）離心20 min處理后取沉淀，行BCA蛋白定量、高溫蛋白變性，電泳；待溴酚藍(lán)接近膠底部時(shí)停止、轉(zhuǎn)膜、春紅溶液染色，室溫下5%脫脂奶粉封閉 2 h，一抗 Caspase－3、NF－κB、β－actin（1∶500）4 ℃過夜；洗膜，二抗（1∶100）37℃恒溫孵育 1 h后經(jīng)ECL顯色。根據(jù)條帶灰度值半定量分析Caspase－3、NF－κB 蛋白表達(dá)。

1.3.5 檢測(cè)抗氧化酶活性和MDA含量 遵照試劑盒步驟處理后通過紫外－可見分光光度計(jì)測(cè)定抗氧化酶（SOD、CAT）活性和MDA含量。

1.3.6 檢測(cè)海馬組織炎癥細(xì)胞因子含量 遵照試劑盒操作處理后通過酶標(biāo)儀測(cè)定海馬組織炎癥細(xì)胞因子（IL－1β、TNF－α、IL－6）含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用軟件SPSS19．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD－t檢驗(yàn)，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu) 假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元層次清晰，排列整齊，形態(tài)完整，核膜、核仁清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常；模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元呈現(xiàn)層次紊亂，排列稀疏、間隙增大、數(shù)量減少，胞體腫脹變形，胞核固縮或溶解等形態(tài)結(jié)構(gòu)病理性改變；與模型組比較，苦參素各劑量組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變呈不同程度改善，該效果以苦參素高劑量組最為顯著。結(jié)果見圖2。

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡狀況 假手術(shù)組大鼠大腦海馬CA1區(qū)僅見少量凋亡細(xì)胞；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增多；與模型組比較，苦參素各劑量組大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)量呈不同程度減少，以苦參素高劑量組最為顯著，見圖3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元AI顯著升高（P＜0．01），而與模型組比較，苦參素中、高劑量組AI顯著降低（P＜0．01）。

2.3 各組大鼠海馬組織Bcl－2、Bax表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織Bcl－2表達(dá)明顯下調(diào)、灰度顯著降低（P＜0．01），Bax表達(dá)顯著上調(diào)、灰度顯著升高（P＜0．01）；與模型組比較，苦參素各劑量組海馬組織Bcl－2表達(dá)上調(diào)、Bax表達(dá)下調(diào)，苦參素對(duì)Bcl－2、Bax表達(dá)的影響呈一定劑量依賴性，調(diào)控效果以苦參素高劑量組最為顯著；與模型組比較，苦參素中、高劑量組Bcl－2表達(dá)灰度值顯著升高（P＜0．05 或 P＜0．01）、Bax表達(dá)灰度值顯著降低（P＜0．01），Bcl－2/Bax比值顯著升高（P＜0．01）。見表1。

圖2 各組大鼠大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE，×400）Fig.2 Morphology and structureof hippocampal CA1 neurons of rat brain in each group(HE,×400)

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡狀況（TUNEL，×400）Fig.3 Apoptosisof neuronsin hippocampal CA1 area of rats in each group(TUNEL,×400)

表1 各組大鼠海馬Bcl-2、Bax表達(dá)灰度值及 Bcl-2/Bax 比值（x±s）Tab.1 Gray value of Bcl-2 and Bax and the ratio of Bcl-2/Bax in hippocampusof ratsin each group（x±s）

2.4 各組大鼠海馬組織Caspase－3、NF－κB蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織Caspase－3、NF－κB 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0．01）；與模型組比較，苦參素中、高劑量組大鼠海馬組織Caspase－3、NF－κB蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0．05 或 P＜0．01）。見表 2。

2.5 各組大鼠海馬組織抗氧化酶活性和MDA含量 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織抗氧化酶（SOD、CAT）活性顯著降低且MDA含量顯著升高（P＜0．01）；與模型組比較，苦參素中、高劑量組大鼠海馬組織SOD、CAT活性顯著提高且MDA含量顯著降低（P＜0．05 或 P＜0．01）。見表 3。

表2 各組大鼠海馬組織Caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)（x±s）Tab.2 Protein expression of Caspase-3 and NF-κB in hippocampus of rats in each group（x±s）

表3 各組大鼠腦組織抗氧化酶活性和MDA含量（x±s）Tab.3 Antioxidaseactivity and MDA contentsin ratsbrain of each group（x±s）

2.6 炎癥細(xì)胞因子含量 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織炎癥細(xì)胞因子（TNF－α、IL－1β、IL－6）含量顯著升高（P＜0．01）；與模型組比較，苦參素中、高劑量組大鼠 TNF－α、IL－1β、IL－6 含量均顯著降低（P＜0．05 或 P＜0．01），結(jié)果見表 4。

表4 各組大鼠海馬組織炎癥細(xì)胞因子含量（x±s）Tab.4 Contentsof inflammatory cytokinein hippocampusof ratsin each group（x±s）nmol/L

3 討論

海馬組織不僅與多種神經(jīng)性和精神性疾病相關(guān)，而且與空間學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，海馬對(duì)缺血缺氧十分敏感，尤其CA1區(qū)椎體系細(xì)胞極易受缺血缺氧損傷[6]，而細(xì)胞繼發(fā)性凋亡是神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的主要形式，因此抑制海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡可能是降低慢性缺血性腦病損傷的有效途徑。

Caspase－3蛋白在細(xì)胞凋亡過程中具有非常關(guān)鍵的調(diào)控作用，參與細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)及整個(gè)過程的調(diào)節(jié)[7]。Bcl－2基因家族是一系列原癌基因蛋白，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其中Bcl－2和Bax具有較高的同源性，但功能相反[8]。Bcl－2能夠通過抑制線粒體細(xì)胞色素C釋放，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活，表現(xiàn)出抑制細(xì)胞凋亡的作用；Bax能夠促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase－9，并且能夠與Bcl－2形成二聚體而抑制Bcl－2活性，因此Bax具有促凋亡的作用，而Bax/bcl－2比值更加能夠體現(xiàn)Bcl－2基因家族對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用[9－10]。此外，體內(nèi)氧自由基（ROS）過剩是細(xì)胞凋亡的重要誘發(fā)因素，而NF－κB蛋白則是連接氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的“橋梁”[11]。正常生理狀態(tài)下NF－κB以無活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，而當(dāng)細(xì)胞受ROS攻擊時(shí)將激活NF－κB蛋白，活化NF－κB進(jìn)入細(xì)胞核并與凋亡相關(guān)基因c－myc等NF－κB調(diào)控元件結(jié)合，促進(jìn)凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]；此外，活化的NF－κB蛋白還能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化和浸潤(rùn)、誘導(dǎo)促凋亡信號(hào)釋放而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。正常生理狀態(tài)下體內(nèi)ROS在抗氧化酶SOD、CAT相繼催化作用下被還原生成H2O和O2[13－14]；細(xì)胞膜主要成分不飽和脂肪酸極易被ROS攻擊生成MDA，因此MDA含量水平能夠間接反映機(jī)體內(nèi)ROS水平[15]。炎癥細(xì)胞因子（TNF－α、IL－1β、IL－6）是臨床上監(jiān)測(cè)炎癥反應(yīng)的常用指標(biāo)，炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[16]，并且NF－κB蛋白在炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡間起到橋梁作用[17]。

苦參（Sophora flavescens Ait．）為豆科苦參屬多年生落葉亞灌木植物苦參的根，為傳統(tǒng)中藥品種之一，《本草綱目》、《神農(nóng)本草經(jīng)》等均有記載，其味苦、性寒，具有清熱燥濕、利水退黃、祛風(fēng)殺蟲之功效；苦參素是苦參的主要有效成分之一，具有抗炎、改善微循環(huán)等藥理學(xué)作用[18－19]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)50～100 mg/kg苦參素治療能夠抑制海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病變并抑制該區(qū)域神經(jīng)元凋亡、降低凋亡指數(shù)，上調(diào)海馬組織Bcl－2表達(dá)、下調(diào)Bax表達(dá)并提高Bcl－2/Bax比值，下調(diào)海馬組織 Caspase－3、NF－κB蛋白表達(dá)，提高SOD、CAT活性并降低MDA含量，降低炎癥細(xì)胞因子 IL－1β、IL－6、TNF－α 含量；提示苦參素具有抑制慢性腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡的藥理學(xué)作用，其機(jī)制可能與苦參素調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)以及提高ROS清除能力有關(guān)。