俞 媛 ，楊雅瓊 ，馮凱強(qiáng) ，屈金輝 ，潘雪梅 ，白 雪 ，王 毅

（1．天津市天津醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300211；2．天津市天津醫(yī)院藥學(xué)部，天津 300211）

骨折愈合是一個(gè)十分復(fù)雜的生物學(xué)過程，歷經(jīng)血腫機(jī)化期、原始骨痂形成期和骨痂改造塑形期，其修復(fù)需要充足的血供和骨折端的穩(wěn)定固定。如何縮短骨折愈合時(shí)間、及早促進(jìn)骨折愈合、減少并發(fā)癥的發(fā)生，是骨科界亙古不變的關(guān)注點(diǎn)。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療骨折有著悠久的歷史，且安全、風(fēng)險(xiǎn)小、療效確切，體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療骨折的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)[1－2]。本研究擬通過建立大鼠脛骨干骨折模型，探索蘇氏接骨膠囊（簡(jiǎn)稱Su）對(duì)骨折早期愈合的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡雄性SD大鼠36只（SPF級(jí)，天津市中西結(jié)合骨科研究所動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量（200±25）g，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為3組，每組12只，分別為假干預(yù)組、Su－140組和Su－280組。標(biāo)準(zhǔn)鼠糧適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲水，室溫（25±2）℃，定期消毒及通風(fēng)。

1.1.2 藥物 Su（天津市天津醫(yī)院藥劑科提供，津藥制字 Z20070616，規(guī)格為每粒 0．25 g）復(fù)方藥物，由骨碎補(bǔ)、土鱉蟲、續(xù)斷、煅自然銅、劉寄奴、川芎、當(dāng)歸、三七粉、五加皮、木瓜、熟地黃、補(bǔ)骨脂、無名異、菟絲子、黨參、黃芪、煅龍骨、白芍和桂枝19味藥物組成。

1.1.3 器材與儀器 一次性無菌注射器（直徑為1mm，碧迪醫(yī)療器械有限公司提供）；大鼠灌胃器（16碼，北京合力科創(chuàng)科技有限公司提供）；金屬克氏針（長150 mm，直徑1．0 mm，北京藍(lán)港神舟醫(yī)療器械有限公司提供）；Micro－CT成像系統(tǒng)（1174V2型，SIEMENS公司，比利時(shí)）。

1.2 方法

1.2.1 骨折模型的制備 使用10%的水合氯醛行腹腔麻醉和常規(guī)消毒后，無菌條件下于右下肢脛骨內(nèi)側(cè)緣從粗隆間向下縱行切口，長約2 cm，逐層切開皮膚并剝離部分肌肉組織，利用一根5 mL注射器針頭（直徑1 mm）于脛骨髕韌帶開口，插入已消毒的克氏針并沿髓腔至脛骨粗隆間，然后線鋸截?cái)辔挥诿劰侵卸吻胺阶罡唿c(diǎn)，致脛骨中段橫行骨折。將克氏針繼續(xù)插入整個(gè)脛骨髓腔（穿過已斷裂的骨折處），剪斷多余的克氏針，遠(yuǎn)端埋于骨皮質(zhì)下。碘伏及0．9%氯化鈉溶液反復(fù)沖洗切口后，使用11號(hào)絲線逐層縫合切口。

1.2.2 術(shù)后處理 術(shù)后立即在麻醉狀態(tài)下拍攝患肢側(cè)位X線片，觀察造模效果。要求骨折類型為脛骨中段橫行或短斜形骨折，骨折端內(nèi)固定理想無明顯移位。周期定時(shí)添足飼料、更換墊料，飲水不限。1.2.3 給藥方法 造模成功后第2天開始通過灌胃方式進(jìn)行相應(yīng)的藥物治療。給藥劑量經(jīng)人－大鼠體表面積比值折算成等效劑量[140 mg/（kg·d）]，蒸餾水配制相應(yīng)濃度的藥物混懸液。每只大鼠的給藥容積為2 mL，假干預(yù)組給予等量的蒸餾水，每日1次至實(shí)驗(yàn)取材。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法和觀察指標(biāo)

1.3.1 標(biāo)本取材 骨折造模術(shù)后第10天，3組大鼠過量麻醉，各組隨機(jī)抽取6只大鼠行心臟取血備用。所有動(dòng)物模型處死后，取患側(cè)脛骨全長標(biāo)本，剔除附著于脛骨干的肌肉，立即行X線檢查。隨后，各組隨機(jī)抽取6只進(jìn)行Micro－CT檢查，剩余6只立即投入10%中性福爾馬林溶液中固定，待用。

1.3.2 骨痂標(biāo)本觀察 取材后肉眼觀察3組大鼠患側(cè)脛骨的骨痂外形，比較3組大鼠骨痂形成的情況以及骨折端的穩(wěn)定程度。

1.3.3 X線檢查 大鼠患側(cè)取材后立即行脛骨全長X線照片，觀察骨折兩端的變化。使用X線機(jī)（XR656型，GE公司，美國）拍攝脛骨側(cè)位X線片，攝片條件為：電壓55 kV，電流 2 mA，曝光時(shí)間13 ms。

1.3.4 Micro－CT檢查 將樣本置于Micro－CT測(cè)試管內(nèi)，沿標(biāo)本長軸方向進(jìn)行掃描，獲取連續(xù)的Micro－CT 圖像，掃描精度：8．52 μm，重建后分辨率：17．2μm，掃描電壓：80 kV，電流 500μA，閾值：1 000，興趣區(qū)：1 600，寬度：2 100。圖像高斯濾波后，以骨折部位為中心進(jìn)行三維重建。利用Inveon Research Wofkplace分析軟件（SIMENS公司，德國）將得到的三維圖像信息進(jìn)行定量分析，計(jì)算樣本骨痂的骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb．Th）、骨小梁數(shù)量（Tb．N）等。

1.3.5 組織學(xué)觀察 取已置于10%中性多聚甲醛溶液中的患側(cè)標(biāo)本，25℃下固定1周。磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗后，將標(biāo)本置于10%乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2，DEPC水配制）脫鈣液中進(jìn)行脫鈣，直至組織軟化為止。脫鈣后用乙醇梯度脫水，使用二甲苯透明處理2 h，石蠟包埋。沿股骨干長軸切片，厚度為5μm，再行蘇木精－伊紅（HE）染色。所用液體試劑均需用DEPC處理或DEPC水配制。每份標(biāo)本隨機(jī)取6張脛骨切片，分別在光學(xué)顯微鏡下觀察骨痂的生長情況。

1.3.6 免疫組化染色 石蠟切片烤片6～8 h后常規(guī)脫蠟，3%H2O2溶液室溫孵育10 min后，枸櫞酸鹽緩沖液抗原熱修復(fù)，滴加牛血清白蛋白（BSA）封閉液，滴加兔抗骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2（BMP－2）多克隆抗體（博士德產(chǎn)品），4℃過夜，37℃復(fù)溫1 h。滴加生物素二抗，室溫30 min，滴加DAB顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染，封片鏡檢。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（Real Time－PCR） 在mRNA水平上分別測(cè)定3組樣本中BMP－2因子的表達(dá)量。Trizol法提取總RNA并測(cè)定總RNA濃度（OD260/280在 1．6～1．8）。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（TIANGEN產(chǎn)品），將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA并定量擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性，95℃，1 min；變性，95 ℃，5 s；退火/延伸，58 ℃，15 s。循環(huán)數(shù)40次。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。GAPDH引物序列：正義鏈：5’－GGTGCTGAGTATGTCGTGGA－3’，反義鏈：5’－TGCTGACAATCTTGAGGGAG－3’；BMP－2 引物序列：正義鏈：5’－CATCCACTCCACAAACGAGA－3’，反義鏈：5’－GTCATTCCACCCCACATCA－3’（上海生工合成）。采用2－ΔCt公式計(jì)算BMP－2的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 19．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。3組間比較采用單因素方差分析。Micro－CT 結(jié)果中藥物濃度與 BV/TV、Tb．Th、Tb．N 的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 X線觀察骨痂形成 術(shù)后10 d，3組大鼠的骨折斷端均可見骨痂形成。骨折端愈合尚穩(wěn)定，部分標(biāo)本骨折斷端微動(dòng)，經(jīng)X線觀察Su－280組骨折端愈合情況好于Su－140組及假干預(yù)組，Su－140組優(yōu)于假干預(yù)組，見圖1。

圖1 大鼠脛骨X線檢查結(jié)果Fig.1 Resultsof X-ray examination of tibia in rats

2.2 Micro－CT檢查結(jié)果 術(shù)后第10天，3組大鼠BV/TV值差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。Su－140組和Su－280組ROI區(qū)域的BV/TV值均大于假干預(yù)組（P＜0．01）。Su－280 組 BV/TV 值大于 Su－140 組（P＜0．01）。Tb．Th3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。Su－280 組與假干預(yù)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。Su－280組與 Su－140 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。Su－140 組與假干預(yù)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。Tb．N3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。Su－280 組與假干預(yù)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），Su－280 組與 Su－140 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），Su－140組與假干預(yù)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。各組 BV/TV、Tb．Th、Tb．N 的數(shù)值與 Su 濃度呈現(xiàn)明顯相關(guān)（P＜0．01），見表 1、圖 2。

表 1 Micro-CT 結(jié)果（x±s）Tab.1 Resultsof Micro-CT（x±s）

圖2 各組大鼠脛骨Micro-CT結(jié)果Fig.2 Micro-CT of tibial of rats in each group

2.3 組織學(xué)觀察 鏡下可見，假干預(yù)組的骨折端有纖維骨痂和軟骨痂形成，但骨小梁較小，間隙較大，結(jié)構(gòu)疏松，血管稀少。Su－140組和Su－280組的骨折端有較多的纖維性和軟骨性骨痂，并在軟骨痂邊緣見到鈣化，可見骨外膜下成骨。同時(shí)，大量骨小梁開始形成，骨小梁間隙內(nèi)可見較多的毛細(xì)血管。Su－280組毛細(xì)血管尤其豐富，且骨小梁的方向開始向著與骨干縱向平行的方向生長，見圖3。

圖3 3組大鼠脛骨骨痂HE染色Fig.3 HEstaining of tibial callusof ratsin threegroups

2.4 免疫組化結(jié)果 3組結(jié)果鏡下顯示，在骨痂內(nèi)軟骨細(xì)胞的礦化區(qū)周圍存在著BMP－2的分布區(qū)域，且隨著干預(yù)藥物濃度的增加，區(qū)域面積增大，BMP－2的表達(dá)增多。且同假干預(yù)組及Su－140組相比，BMP－2分布增多的Su－280組骨痂內(nèi)軟骨細(xì)胞的礦化區(qū)面積增大，骨小梁數(shù)量增多，并趨向沿脛骨干縱軸的方向排列，見圖4。

圖4 3組大鼠脛骨骨痂中BMP-2的表達(dá)（免疫組化染色，×100）Fig.4 Expression of BMP-2 in thetibial callus of the three groups(immunohistochemical staining,×100)

2.5 Real Time－PCR結(jié)果 BMP－2在mRNA水平的表達(dá)量顯示，3組大鼠的組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。其中，Su－280 組 BMP－2 表達(dá)量（7 114．75±1 474．67）高于假干預(yù)組（3 228．56±187．86）和 Su－140 組（4 163．96±678．88），差異顯著（P＜0．05），假干預(yù)組同 Su－140 組間差異不顯著（P＞0．05），見表 2。

表2 BMP-2的Real Time-PCR結(jié)果Tab.2 Real Time-PCR resultsof BMP-2

3 討論

意外創(chuàng)傷引發(fā)的骨折最近幾年顯著增多，骨折斷端的快速愈合是減少骨折后并發(fā)癥的關(guān)鍵所在。骨折愈合是骨組織完全再生的過程，其修復(fù)經(jīng)過纖維骨痂、軟骨骨痂至成熟的骨性骨痂階段。骨折早期，在骨折斷端與其周圍形成血腫，富含大量生長因子，并吸引大量炎性細(xì)胞浸潤以清除壞死組織，為骨折修復(fù)創(chuàng)造有利條件。BMP－2是唯一能夠單獨(dú)誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向骨組織方向分化的生長因子，是骨組織形成過程中最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，具有誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞的遷徙、增殖、分化，最終導(dǎo)致軟骨形成的作用[3]。傳統(tǒng)的中醫(yī)藥治療骨折有著悠久的歷史，且安全、風(fēng)險(xiǎn)小、無手術(shù)創(chuàng)傷，填補(bǔ)了西醫(yī)治療骨折的弊端。本研究通過建立大鼠脛骨干骨折模型，骨折愈合過程中給予傳統(tǒng)中藥Su進(jìn)行治療，結(jié)果顯示，在骨折愈合早期，Su促進(jìn)了骨痂中BMP－2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)大鼠脛骨干骨折的早期愈合。

Su是天津醫(yī)院臨床常用院內(nèi)制劑（津藥制字Z20070616），由骨碎補(bǔ)、土鱉蟲、續(xù)斷、煅自然銅、劉寄奴、川芎、當(dāng)歸、三七粉、五加皮、木瓜、熟地黃、補(bǔ)骨脂、無名異、菟絲子、黨參、黃芪、煅龍骨、白芍和桂枝19味藥物組成。方中以骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、土鱉蟲3味主藥配合，補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、破瘀血、續(xù)折傷，治療骨折損傷、瘀滯疼痛，通過補(bǔ)腎氣以達(dá)到主骨生髓、促進(jìn)骨折愈合的目的，共為君藥。該方劑以骨折三期治則為指導(dǎo)原則，從整體出發(fā)，舒筋活血，補(bǔ)腎壯骨[4－5]?，F(xiàn)代研究將傳統(tǒng)中醫(yī)與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，已證實(shí)活血化瘀能通過增強(qiáng)骨生長因子成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）－2、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、BMP－2和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）－β1等的表達(dá)促進(jìn)骨折的愈合[6－12]。本研究通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)從微觀探討中藥Su促進(jìn)骨折早期愈合的機(jī)制。應(yīng)用傳統(tǒng)的骨影像學(xué)可觀察到大鼠脛骨干骨折早期愈合的情況。經(jīng)Micro－CT技術(shù)[13－14]重建了骨折斷端骨痂的三維圖像，并進(jìn)行定量分析，得到了骨痂的相關(guān)形態(tài)學(xué)參數(shù)。在離體空間更精確地反映了骨痂形態(tài)和骨痂礦化的過程，明確了蘇氏接骨膠囊對(duì)骨折早期愈合的影響深度及愈合程度對(duì)該方劑藥物濃度的依賴性。同時(shí)，骨痂組織HE染色及免疫組化結(jié)果顯示，同假干預(yù)組比較，給予中藥灌胃治療的實(shí)驗(yàn)組大鼠，其骨折斷端的軟骨細(xì)胞礦化區(qū)面積增大，骨小梁數(shù)量增多，血管更加豐富，分布于骨小梁間的BMP－2蛋白更為廣泛。Real Time－PCR的定量檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著不同劑量中藥的干預(yù)，在mRNA水平上，各組之間BMP－2的表達(dá)量存在顯著的差異。BMP－2誘導(dǎo)成骨有3個(gè)條件[3]：首先，有效的BMP－2濃度；其次，存在BMP－2的靶細(xì)胞群；最后，正常的骨生長環(huán)境。本研究顯示，BMP－2的表達(dá)量隨著藥物干預(yù)濃度的增加而增加，骨折愈合的也越好。這有可能是高劑量的BMP－2通過激活以下2個(gè)信號(hào)通路BMP－2/Smads/Runx2/Osterix或BMP－2/Smads/Msx2/Osterix來促進(jìn)骨折的早期愈合。

綜上所述，中藥Su能促進(jìn)大鼠骨折斷端骨痂內(nèi)BMP－2的生成及骨折的早期愈合，在分子生物學(xué)水平為中藥治療骨折愈合提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。