王 波,王 幸,周興根,黃忠勤,丁震乾,常 勇,周澗楠,蘇在興

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學研究所,江蘇 徐州 221131)

多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)是一種產(chǎn)芽孢的G+細菌,由于其具有植物病害防治、促進植物生長、對人和動植物無致病性并且無污染等優(yōu)點而受到重視,美國環(huán)保署(EPA)將其列為可在商業(yè)上推廣應用的微生物之一[1],我國農(nóng)業(yè)部也將其列為免做安全鑒定的一級菌種[2]。近年來,關于多粘類芽孢桿菌用于植物病害生物防治的報道越來越多,例如：胡飛等研究發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌對水稻紋枯病有較好的防治效果[3];李峰等篩選到1株對小麥赤霉病菌有抑制作用的多粘類芽孢桿菌菌株[4];林營志等篩選并鑒定了4株生防多粘類芽孢桿菌,其中菌株FJAT-4539對香蕉枯萎病有很強的抑制作用[5];宋順華等發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌對西瓜枯萎病具有較好的防治效果[6-7]。多粘類芽孢桿菌XZ-2是本課題組從江蘇省徐州市銅山區(qū)班井村大豆植株中分離篩選出的,該菌株具有廣譜抗真菌活性,對多種病原菌如大蒜葉枯病菌[Pleosporaherbarum(Pers.ex Fr.) Rabenk]、黃瓜灰霉病菌(Botrytiscinerea)、甘薯黑斑病菌(CeratocystisfimbriataEllis et Halsted)、絲瓜炭疽病菌(Colletotrichumorbiculare)、甜瓜枯萎病菌[Fusariumoxysporum(Schl.) f. sp.melonis]、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、小麥紋枯病菌(RhizoctoniacerealisVander Hoeven)、棉花黃萎病菌(VerticilliumdahliaeKleb)、大豆疫霉病原菌(Phytophthorasojae)、大豆炭疽病原菌(Soybeananthracnose)、大豆菌核病原菌[Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary]等均具有較強的抑菌活性(另文發(fā)表)?；谠摼甑膹V譜抗菌活性,我們初步認為該生防菌株具有較好的應用前景。本文采用單因素實驗設計和正交實驗設計相結合的方法,對多粘類芽孢桿菌菌株XZ-2的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化研究,以期為該生防菌株的大規(guī)模生產(chǎn)奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

多粘類芽孢桿菌XZ-2從江蘇省徐州市銅山區(qū)班井村大豆植株中分離,經(jīng)江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學研究所大豆課題組篩選鑒定后保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.2 培養(yǎng)基

多粘類芽孢桿菌XZ-2菌株發(fā)酵基礎培養(yǎng)基使用LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L、蒸餾水1000 mL, pH 7.0),在121 ℃高壓蒸汽下滅菌20 min。菌株活化采用LBA固體培養(yǎng)基(上述LB液體培養(yǎng)基+瓊脂粉15 g/L)。

1.3 菌體生物量的測定

采用酶標儀(Thermo Multiskan GO, USA),取300 μL發(fā)酵液于酶標板中,以LB液體培養(yǎng)基為對照,測定OD600值,以OD600值作為判斷菌體生物量大小的標準,OD600值大則菌量大[8]。

1.4 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

碳源:以LB液體培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別用酵母提取物、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和可溶性淀粉作為碳源,制成含有10 g/L單一碳源的LB液體培養(yǎng)基(100 mL/250 mL)。將活化后的菌懸液以5%(體積分數(shù))分別接種到不同碳源的液體培養(yǎng)基中,置于28 ℃、180 r/min轉(zhuǎn)速搖床中培養(yǎng)24 h后取出,在酶標儀上測定OD600值,每個處理3次重復。

氮源:采用賴氨酸、蛋白胨、磷酸二氫銨、氯化銨和L-天冬酰胺，分別制成含10 g/L單一氮源的LB液體培養(yǎng)基；其他接種、培養(yǎng)和測定方法同上,每個處理3次重復。

無機鹽:分別向LB液體基礎培養(yǎng)基中加5 g/L的硫酸鋅、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈣、氯化鉀；其他接種、培養(yǎng)和測定方法同上,每個處理3次重復。

多因素正交實驗:以單因素實驗篩選出的最佳碳源蔗糖、最佳氮源蛋白胨以及無機鹽硫酸鎂和氯化鈣等4個變異因素,采用如表1所示的L9(34)正交表進行培養(yǎng)基優(yōu)化試驗,培養(yǎng)基pH值為7.0,在發(fā)酵溫度為28 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h,以OD600值分析4因素3水平對菌體生物量的影響,確定培養(yǎng)基的最佳配方,每個處理3次重復[9]。

表1 L9(34)正交實驗設計因素 g/L

1.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

單因素實驗設計參考趙爽等的設計方法[10-12],在優(yōu)化得到的培養(yǎng)基基礎上,分別對培養(yǎng)基的初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量以及接種量進行進一步優(yōu)化。用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH將培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)成4、5、6、7、8、9,每個處理裝液量為150 mL,然后接種5%的菌懸液,在轉(zhuǎn)速180 r/min、發(fā)酵溫度28 ℃條件下?lián)u培24 h后測定OD600值。將發(fā)酵溫度設置為20、25、30、35、40、45 ℃,接種量、轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)時間等其他條件及測定方法同上。將發(fā)酵時間設置為12、24、36、48、60、72 h,其他培養(yǎng)條件不變。將轉(zhuǎn)速設置為90、120、150、180、210、240 r/min,其他培養(yǎng)條件不變。在250 mL三角瓶中分別裝培養(yǎng)基40、60、80、100、120、140 mL,其他培養(yǎng)條件不變。按體積分數(shù)將接種量設置為1%、3%、5%、7%、9%、11%,其他培養(yǎng)條件不變,分別測定OD600值,每組試驗設置3次重復。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel軟件處理實驗數(shù)據(jù)和作圖,采用生物統(tǒng)計分析軟件DPS進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 多粘類芽孢桿菌XZ-2的培養(yǎng)基優(yōu)化

分別以酵母提取物、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和可溶性淀粉作為碳源,研究它們對多粘類芽孢桿菌XZ-2生物量的影響。結果如圖1所示,在供試的5種碳源中,蔗糖作為碳源時XZ-2的生長量最大,其發(fā)酵液OD600值達到0.805,與其他4種碳源培養(yǎng)基上得到的生物量呈極顯著差異;其次是葡萄糖和可溶性淀粉,其OD600值分別為0.626和0.586;以麥芽糖和酵母提取物作為碳源的培養(yǎng)基上得到的生物量較小,其OD600值分別為0.428和0.327。因此選取蔗糖作為最佳碳源。

圖中不同大寫字母表示1%極顯著水平差異。下同。

由于有機氮源成本較高,因此本研究以無機氮源為主,結果如圖2所示。菌株XZ-2在以蛋白胨作為培養(yǎng)基的氮源時生物量最大,其OD600值為0.677,與其他4種氮源條件下培養(yǎng)獲得的生物量呈極顯著差異;其次為磷酸二氫銨和氯化銨,其獲得的OD600值分別為0.423和0.286;而在以L-天冬酰胺和賴氨酸為氮源的培養(yǎng)基上獲得的生物量較小,其OD600值分別為0.139和0.053。因此選取蛋白胨作為培養(yǎng)基的最佳氮源。

圖2 不同氮源對多粘類芽孢桿菌XZ-2生長的影響

分別以硫酸鎂、氯化鈣等5種無機鹽制備培養(yǎng)基,發(fā)酵結果如圖3所示。以硫酸鎂和氯化鈣為培養(yǎng)基的無機鹽時OD600值較高,分別為0.568和0.553,與其他3種無機鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的生物量呈極顯著差異；以硫酸鋅和硫酸錳為培養(yǎng)基的無機鹽時,OD600值很小,菌株生長非常緩慢。由于以硫酸鎂和氯化鈣作為無機鹽的條件下該菌株的生長量沒有極顯著差異,因此下一步采用硫酸鎂和氯化鈣作為培養(yǎng)基的復合無機鹽。

圖3 不同無機鹽對多粘類芽孢桿菌XZ-2生長的影響

2.2 正交實驗培養(yǎng)基成分優(yōu)化

從表2、表3中可以看出：不同水平的蔗糖和蛋白胨對XZ-2的生長量有一定的影響,具體表現(xiàn)為蔗糖和蛋白胨的濃度越高,XZ-2的生長量越高,極差分別為0.141和0.088;不同水平的硫酸鎂對XZ-2的生長量也有一定的影響,XZ-2的生長量隨著硫酸鎂濃度從3 g/L增加到5 g/L而不斷增加,但當硫酸鎂濃度從5 g/L增加到7 g/L時XZ-2的生長量反而下降,極差為0.073;不同水平的氯化鈣對XZ-2生長量的影響表現(xiàn)為隨著濃度升高而下降,極差為0.051。結合正交實驗結果,確定該菌株的最適發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:蔗糖15 g/L,蛋白胨15 g/L,硫酸鎂5 g/L和氯化鈣3 g/L。

表2 培養(yǎng)基組分正交實驗統(tǒng)計結果

注：括號外為設計的水平值，括號內(nèi)為設計的實際濃度值(計量單位為g/L)。

表3 培養(yǎng)基組分正交實驗評價結果發(fā)酵液的OD600值)

注: K1、K2、K3分別代表蔗糖、蛋白胨、硫酸鎂和氯化鈣的3種水平與其他因素組合時XZ-2發(fā)酵液的OD600值。

2.3 XZ-2培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 初始pH值的優(yōu)化 由圖4a可見,不同初始pH條件對多粘類芽孢桿菌XZ-2的發(fā)酵有一定的影響。具體來說：當pH值為4～8時,XZ-2菌株的生長量呈上升趨勢；當pH值為8時,XZ-2發(fā)酵液的OD600最大,達到0.727;但pH值在6～8條件下發(fā)酵液的OD600值差異較小;當培養(yǎng)基初始pH值為9時,該菌株的生長量極低。因此,多粘類芽孢桿菌XZ-2發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳初始pH值為8。

2.3.2 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化 圖4b表明溫度對多粘類芽孢桿菌XZ-2的生長有較大的影響。當溫度為20～30 ℃時,隨著溫度的升高菌株XZ-2的生長量快速升高；當溫度為30 ℃時,XZ-2發(fā)酵液的OD600值達到最大，為0.784;當發(fā)酵溫度在30～45 ℃時,隨著溫度升高菌株的生長量逐漸降低,且在45 ℃條件下生長量極低。因此,確定30 ℃為該菌株的最佳發(fā)酵溫度。

2.3.3 培養(yǎng)時間的優(yōu)化 由圖4c可見：XZ-2菌株在培養(yǎng)時間為12～24 h時,發(fā)酵液的OD600值顯著升高,搖培24 h時發(fā)酵液的OD600值高達0.715;繼續(xù)搖培后發(fā)現(xiàn)菌株的生長量逐漸下降。由此,我們認為該菌株的最佳發(fā)酵時間為24 h,該結果與菌株XZ-2的生長曲線結果一致。

2.3.4 裝液量的優(yōu)化 不同的裝液量對菌株XZ-2的發(fā)酵有一定的影響,結果如圖4d所示,在250 mL三角瓶中,XZ-2的生長量隨著裝液量的增加而增加,當裝液量達到80 mL時,XZ-2發(fā)酵液的OD600值最高,為0.811;隨著裝液量繼續(xù)增加,XZ-2發(fā)酵液的OD600值逐漸下降,但下降趨勢較小。因此,選擇250 mL三角瓶裝液80 mL為菌株XZ-2的最佳裝液量。

2.3.5 接種量的優(yōu)化 接種量對菌株XZ-2發(fā)酵的影響如圖4e所示,當接種量從1%增加到3%時,XZ-2發(fā)酵液的OD600值快速升高,當接種量在3%時,XZ-2發(fā)酵液的OD600值最大,為0.818；隨著接種量繼續(xù)增加,XZ-2發(fā)酵液的OD600值逐漸下降。說明高接種量和低接種量都不利于該菌株的生長,因此確定該菌株的最佳接種量為3%。

2.3.6 轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 從圖4f可以看出,搖床轉(zhuǎn)速對XZ-2的生長影響較大。當轉(zhuǎn)速在90～180 r/min之間時,隨著轉(zhuǎn)速的升高,該菌株的生長量逐漸升高;當轉(zhuǎn)速為180 r/min時OD600最大,為0.723;當轉(zhuǎn)速繼續(xù)升高時,菌株發(fā)酵液的OD600值則逐漸下降,因此認為180 r/min為菌株XZ-2發(fā)酵培養(yǎng)的最佳轉(zhuǎn)速。

圖4 不同發(fā)酵條件對多粘類芽孢桿菌XZ-2生長的影響

3 討論與結論

單因素試驗是在假設不同因素間不存在相互作用的前提下,通過一次只改變一個因素而其他因素維持不變,研究不同因素對結果的影響,是試驗中最常用的優(yōu)化策略之一[12]。然而,大部分培養(yǎng)基成分復雜,僅通過單因素試驗往往無法獲得準確的結果,特別是在試驗因素較多的情況下,需要進行較多的試驗次數(shù)和試驗周期才能完成各因素的逐個優(yōu)化篩選[13-14]。因此,單因素試驗經(jīng)常被用在正交試驗之前或與正交試驗相結合使用。正交試驗是利用一套表格,設計多因素、多指標、多因素間存在交互作用而具有隨機誤差的試驗,并利用普通的統(tǒng)計分析方法來分析試驗結果[15]。本文采用單因素實驗設計和正交實驗設計相結合的方法,對XZ-2的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。單因素實驗結果表明XZ-2的最佳碳源為蔗糖,最佳氮源為蛋白胨,最佳無機鹽為硫酸鎂和氯化鈣;結合單因素實驗結果開展正交實驗,結果顯示該菌株的最佳培養(yǎng)基組分為蔗糖15 g/L,蛋白胨15 g/L,硫酸鎂5 g/L,氯化鈣3 g/L。同時,通過研究優(yōu)化了菌株XZ-2的發(fā)酵條件:培養(yǎng)基初始pH值8,發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵時間24 h,裝液量80 mL/250 mL,接種量3%,轉(zhuǎn)速180 r/min。

近年來,關于多粘類芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化的相關報道有很多,如陳小煌等研究發(fā)現(xiàn)：多粘類芽孢桿菌菌株B-306的最適培養(yǎng)基為:碳源可溶性淀粉17.5 g/L、氮源蛋白胨25.0 g/L、無機鹽NaCl 1.25 g/L、Na2HPO40.5 g/L、CaCl21.0 g/L;最適發(fā)酵條件為:初始pH值7.5,培養(yǎng)溫度30 ℃,轉(zhuǎn)速170 r/min,裝液量80 mL/250 mL,接種量10%[7]。金莉萍等對多粘類芽孢桿菌CF05的發(fā)酵條件進行優(yōu)化,結果篩選出碳源豆粕10 g/L和魚粉10 g/L,氮源玉米粉20 g/L,無機鹽MgSO40.5 g/L和CaCl20.5 g/L為最適培養(yǎng)基配方,且初始pH值7.2、培養(yǎng)溫度30 ℃、接種量2%為該菌株的最適發(fā)酵條件[16]。林茂茲等研究表明多粘類芽孢桿菌S960的最佳發(fā)酵條件是:初始pH值7.0,轉(zhuǎn)速150 r/min,裝液量25 mL/250 mL,接種量2%[17]。王智文等對Cp-S316菌株抗真菌活性物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)最佳培養(yǎng)基配方為土豆100 g、乳糖40 g、蛋白胨15 g、硝酸鈉0.5 g、硫酸鎂2 g、水1 L,最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基初始pH值6.3～6.5,培養(yǎng)溫度30 ℃,接種量2%,裝液量100 mL/500 mL[18]。對比以上研究結果和本文研究結論,我們發(fā)現(xiàn)不同多粘類芽孢桿菌菌株的培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件之間存在差異,這可能與菌株的地理來源和采集環(huán)境相關。對此,我們應根據(jù)菌株差異選擇相應的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件,使該菌株的生長和防治效果得到最佳發(fā)揮。以后,我們還將進一步研究培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件對XZ-2發(fā)酵液抑菌活性的影響,為該菌株的開發(fā)應用提供理論依據(jù)。