祁宏英,徐洪國,楊偉麗

(1.齊齊哈爾大學 生命科學與農(nóng)林學院,黑龍江 齊齊哈爾 161006;2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

香水百合(Liliumoriental hybrid ‘Casa Blanca’)為百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生鱗莖類球根花卉,是重要的切花和盆花植物[1]。香水百合花色艷麗,芳香宜人,被譽為百合中的“女王”,是盆栽和點綴花園、庭院的名貴花卉,也是世界各地廣泛應用的切花材料[2-3]。香水百合通常采用分鱗莖、分珠芽、扦插的無性繁殖方法進行繁殖,但是采用傳統(tǒng)繁殖方法極易感病,導致鱗莖逐年變小退化,繁殖系數(shù)也比較低,所以在短期內(nèi)難以滿足市場需求,目前國內(nèi)百合切花生產(chǎn)所用的優(yōu)質(zhì)種球仍依賴從國外進口[1,4]。百合組培苗具有繁殖系數(shù)高、繁殖周期短等優(yōu)點,剛好彌補了種球繁育的不足,而且容易保持原品種的優(yōu)良觀賞特性,對保護百合品種資源具有重要的理論意義和實踐意義。百合的再生能力強,鱗片、葉片、花絲、花藥、花瓣、珠芽、種子、胚等離體培養(yǎng)前人均有報道。崔祺等[5]報道淡黃花百合種子萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基為MS+0.01 mg/L NAA+60 g/L蔗糖,適于‘索邦’、‘雷山3號’鱗片誘導不定芽的培養(yǎng)基分別為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA和MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA;劉雅莉等[6]以花梗、花托、花瓣和花絲為外植體均可直接誘導產(chǎn)生不定芽,誘導不定芽的適宜培養(yǎng)基為N6+BA 1.0 mg/L +KT 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L;農(nóng)艷豐等[7](2014)對OT型百合的花蕾和半開花的不同部位進行了愈傷組織誘導,誘導從易到難表現(xiàn)為子房>柱頭>花藥>花托>花絲、花瓣,其中子房和柱頭的愈傷組織誘導率均超過50.0%。王雅楠等[8]認為新疆百合鱗片最適的誘導培養(yǎng)基為MS+1 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA;不同部位鱗片的誘導率為內(nèi)層>中層>外層、中部>下部>上部；最適增殖培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA,增殖系數(shù)達3.46;最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L,生根率達100%。謝松林等[9]對百合雜種幼胚進行了離體培養(yǎng),胚、胚乳及胚珠3種外植體的離體培養(yǎng)萌發(fā)率分別為100.0%、21.5%和1.0%,認為胚、胚乳及胚珠培養(yǎng)是從幼胚獲得百合雜種植株的高效途徑。?？返萚10]利用無菌葉片、花器官培養(yǎng)獲得的無菌小鱗片及葉片為材料建立了無性快繁體系。

正交試驗方法是利用正交表進行科學的安排與分析多因素試驗的方法。其主要優(yōu)點是能在很多試驗方案中挑選出代表性強的少數(shù)幾個試驗方案,并且通過對這少數(shù)試驗方案實驗結(jié)果的分析,推斷出最優(yōu)方案。目前關于百合快繁的研究雖然很多,但多數(shù)都是單獨研究外植體的,或者培養(yǎng)基的篩選,將外植體和激素濃度組合在一起進行探討的相對較少。影響百合鱗莖試管苗誘導的因素有很多,培養(yǎng)條件的篩選工作量較大。為了降低實驗次數(shù),節(jié)約實驗成本,我們以香水百合的鱗片為外植體,采用正交設計L9(34)對香水百合小鱗莖的誘導因子進行了研究,以期建立百合小鱗莖大量繁殖的技術流程,為國內(nèi)百合商品種球的大量生產(chǎn)提供理論依據(jù),為百合的遺傳轉(zhuǎn)化和基因工程育種提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

香水百合(Liliumoriental hybrid ‘Casa Blanca’ )。

1.2 外植體的選取及消毒

選取無病蟲害、外觀整齊干凈、光滑的香水百合的鱗莖,用流水沖洗60 min左右,直到把鱗莖表面的泥土污垢沖干凈為止。在無菌操作臺上先把鱗莖分成外層、中層和內(nèi)層，放于標記好的錐形瓶中,用75%的酒精浸泡1 min,然后用0.1%的升汞浸泡10 min,期間不斷搖晃錐形瓶,使其消毒充分均勻；最后用無菌水沖洗3～4次。

1.3 試驗設計

采用L9(34)正交試驗設計(表1、表2),在接種操作中把分撥下來的鱗片按形態(tài)學上、中、下3部分切成0.5 cm× 0.5 cm的小塊,分別接種到添加了不同濃度激素組合的MS(蔗糖含量為3%,瓊脂含量為0.7%)初代培養(yǎng)基上,且在整個培養(yǎng)的過程中香水百合的鱗片都是以內(nèi)側(cè)的一面向上接種到培養(yǎng)基中[11],每瓶接種5塊,每個處理接種6瓶,3次重復。每周觀察外植體的變化,培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計鱗片分化試管鱗莖數(shù),計算分化數(shù)和分化率。

表1 試管鱗莖誘導正交試驗因素及其水平

表2 試管鱗莖誘導正交試驗設計

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香水百合試管鱗莖誘導正交試驗結(jié)果

正交試驗各處理均重復3次,取其平均值,并將各項數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。根據(jù)試驗結(jié)果求出每個因素每一水平下的分化數(shù)平均值Ki,并求出同一因素不同水平間平均值的極差R。從表3中的R值可以看出，各因素對誘導試管鱗莖的影響從大到小依次為NAA>6-BA>鱗片層次>鱗片部位。Ki值反映了不同因素各水平對試管鱗莖誘導的影響情況,Ki值越大,誘導效果越好。根據(jù)表3中4個因素各水平下的Ki值，可知香水百合試管鱗莖誘導的最優(yōu)條件組合為A2B3C2D2,即基本培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+中層鱗片+鱗片中部部位的組合。該最佳組合并沒有在正交表中出現(xiàn),但與6號處理接近,僅鱗片層次不同,平均再生芽數(shù)達到了4.56。

2.2 正交試驗結(jié)果的方差分析

用SPSS軟件對正交試驗中香水百合鱗片分化試管鱗莖的平均數(shù)進行方差分析。表4中的F值表明：除鱗片部位外,其余的因素(NAA濃度、6-BA濃度、鱗片層次)各水平對試管鱗莖平均分化數(shù)的影響均達到了極顯著水平(P<0.01),可進一步進行因素內(nèi)多重比較分析；其中NAA濃度對試驗結(jié)果的影響最大。多重比較分析結(jié)果表明：0.1 mg/L NAA的誘導效果最佳，顯著優(yōu)于其他2個濃度水平下的；6-BA濃度對試驗結(jié)果的影響僅次于NAA,其最佳濃度為2.0 mg/L；鱗片部位對分化數(shù)結(jié)果的影響并不顯著,無統(tǒng)計意義,因此3個部位的鱗片都可以作為香水百合的外植體。

表3 香水百合試管鱗莖誘導正交試驗結(jié)果及分析

注:Ki為各因素在各個水平下的分化數(shù)平均值;R為極差。

表4 香水百合試管鱗莖誘導正交試驗的方差分析結(jié)果

注:“**”代表達到0.01顯著水平。

2.3 香水百合試管鱗莖最佳誘導條件的驗證

利用正交試驗法得到香水百合試管鱗莖誘導的最佳條件為基本培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA +2.0 mg/L 6-BA+中層鱗片+鱗片中部部位的組合。在此條件下進行誘導香水百合試管鱗莖的驗證試驗,結(jié)果誘導率達到100%,平均分化數(shù)達到4.89。

3 討論

誘導鱗片外植體形成試管鱗莖時,內(nèi)層鱗片的分化效果較好,這與大多數(shù)學者的研究結(jié)果[8-9]一致。鱗片部位在本試驗中對小鱗莖分化數(shù)結(jié)果的影響并不顯著,這與趙靜等[13]的研究結(jié)果有所不同,可能與材料特性有關。在試管鱗莖的誘導中一般使用細胞分裂素與生長素的配比,但過高濃度的生長素容易使試管鱗莖的誘導力降低,產(chǎn)生大量愈傷組織或不定根；一般認為MS培養(yǎng)基較適于百合的離體培養(yǎng),添加外源激素以6-BA和NAA配比為佳。本試驗結(jié)果表明,香水百合組織培養(yǎng)的最佳分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，在此條件下可得到很高的分化率和分化數(shù)。

正交試驗法是一種高效率、快速、經(jīng)濟的實驗設計方法[14]。該方法在植物組織培養(yǎng)中有著重要的應用價值,在百合組織培養(yǎng)中也有所應用[2,15-16]。但多數(shù)學者僅依據(jù)極差值對正交試驗數(shù)據(jù)進行分析,而未進行方差分析。方差分析法不僅是對正交試驗結(jié)果進行準確分析的保證，而且也是檢驗該試驗結(jié)果是否可靠的重要方法[17]。本文通過正交試驗一次性對香水百合試管鱗莖誘導過程中最主要的4個因素(NAA、6-BA、鱗片層次和鱗片部位)進行了有重復的極差分析和方差分析研究,探究了不同因素的影響大小，并篩選出香水百合試管鱗莖誘導的最佳組合條件,這為下一步開展香水百合再生體系的構(gòu)建和進行遺傳轉(zhuǎn)化奠定了理論基礎。