凌士鵬，孫 萍，林賢銳，沈建生

(浙江省金華市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 金華 321000)

桃是薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)植物，起源地是中國的西部地區(qū)，分布點主要是歐、亞、美、澳、非等五大洲，其種植范圍特別廣、適應性比較強、種質(zhì)資源極為豐富[1]。桃經(jīng)過多年的自然選擇和人工馴化種植，形成了許多的類型和品系，這些資源為進一步改良桃的相關性狀提供了基礎，了解這些資源是利用的前提[2]。目前，相關研究表明：我國擁有北京、南京、鄭州3個國家級桃種質(zhì)資源圃以及很多地方桃種質(zhì)資源圃，收集并保存了6個種，共2000多份種質(zhì)資源[3]，桃作為世界上栽培最為廣泛的落葉果樹之一，現(xiàn)已遍布全球，居核果類果樹之首[4]。自20世紀80年代以來，國內(nèi)很多學者對桃亞屬種間分類進行了研究，目前已經(jīng)在形態(tài)學[1]、酶學[5]、孢粉學[6]、細胞學[7]、分子標記[8-11]等方面獲得了一些桃資源分類及親緣關系等的結(jié)論和觀點。但是研究發(fā)現(xiàn)，從形態(tài)學方面對品種進行分類需要看經(jīng)驗，因此對于一些種間的雜種進行歸類十分困難，更無法判斷其起源；另外，利用同工酶、染色體核型等試驗手段也同樣面臨著更多的問題。因此開展桃分子標記輔助分類具有重要意義。

簡單序列重復(Simple Sequence Repeat，SSR)標記的特點是等位基因變異數(shù)多、信息含量及多態(tài)性高，穩(wěn)定性、重復性好，屬共顯性遺傳，特異性強，并且在種屬間有良好的通用性[14]，是目前果樹上鑒定種質(zhì)資源、分析遺傳多樣性及親緣關系應用中最為廣泛的分子標記。同時，Verde等[12]基于桃不同器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)研究后上傳至NCBI共80797條ESTs序列，為挑選更好的桃SSR引物提供了豐富的資源。筆者所在課題組已于前期對部分桃種質(zhì)資源進行了調(diào)查、收集保存，因此在此基礎上，本研究利用SSR分子標記技術對收集保存的桃種質(zhì)資源進行遺傳多樣性的評價，以期為后續(xù)桃種質(zhì)資源的綜合利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 植物材料

于各地收集桃地方品種(品系)共53份，嫁接于浙江省金華國家高科技農(nóng)業(yè)園區(qū)的桃李品種園，詳細內(nèi)容見表1。試驗材料為健康幼嫩葉片，采集并分別置于采集袋內(nèi)，同時利用變色硅膠迅速干燥，帶回實驗室，挑取干燥的葉片進行DNA提取。

表1 供試的桃品種(品系)

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 采用CTAB法[13]從采集的葉片中提取總DNA，用雙蒸水稀釋到10～30 ng/μL，儲存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 SSR標記 隨機抽取8個桃樣品的DNA模板，選用56對SSR引物進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物利用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳約2.5 h，后銀染顯色。從中篩選出12對擴增條帶清晰、穩(wěn)定的引物進行SSR擴增，詳見表2。試驗前對篩選好的12對引物進行熒光修飾，即在單向引物的5′端或3′端加上熒光修飾基團，便可實現(xiàn)微衛(wèi)星多態(tài)性的熒光半自動檢測。熒光引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

PCR 反應體系及SSR擴增程序詳見孫萍等[17]2017年發(fā)表的文章。擴增結(jié)束后對PCR產(chǎn)物用滅菌的雙蒸水稀釋100～200倍，利用ABI 3130測序儀進行毛細管電泳檢測；數(shù)據(jù)采集采用Gene Mapper 4.0儀器在電泳結(jié)果60～350 bp片段大小范圍內(nèi)進行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將測序的結(jié)果導入Genetic Profile v1.0軟件中，參照峰值的強度及分子內(nèi)標大小，確定微衛(wèi)星位點擴增片段的區(qū)間，對片段大小進行統(tǒng)計，如果出現(xiàn)多峰型的樣品，則需重新進行PCR試驗后重新檢測，以Excel格式保存統(tǒng)計結(jié)果，以備后續(xù)分析[17]。

利用遺傳數(shù)據(jù)分析軟件GenAlEx 6.3[18]計算多態(tài)性等位基因數(shù)(Na)、SSR位點的有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon多樣性指數(shù)(I)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)等遺傳多樣性指標。

用Population 1.2[19]軟件對53個桃種質(zhì)資源進行Neighbor-Joining聚類分析，并描繪和修改聚類圖[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR擴增產(chǎn)物的多態(tài)性

從表3可以看出，12對SSR引物在所有桃樣品中的多態(tài)性等位基因數(shù)(Na)從6到11不等，等位基因數(shù)平均值為7.917。有效等位基因數(shù)(Ne)從1.773(CPPCT042)到4.657(BPPCT026)，平均值為3.399。其中，引物CPPCT022擴增出的等位基因數(shù)為11個，可以區(qū)分53個品種中的22個品種；多態(tài)性較好的引物為CPPCT022、BPPCT038、CPPCT026、BPPCT025、UDP96-005，能區(qū)分幾乎所有53個桃地方品種。

在本研究中，觀察雜合度(Ho)為0.436(CPPCT042)～0.922(BPPCT038)，平均值為0.657。期望雜合度(He)為0.436(CPPCT042)～0.785(BPPCT026)，平均期望雜合度為0.678。Shannon多樣性指數(shù)(I)為0.939(CPPCT042)～1.698(BPPCT038)，平均值為1.409。反映了所收集保存的桃種質(zhì)資源的遺傳變異程度較高，遺傳多樣性較高。

表2 SSR引物及擴增的長度范圍

表3 53個栽培桃品種12對引物的遺傳參數(shù)

2.2 聚類分析

通過SSR數(shù)據(jù)對53個地方桃品種進行聚類分析，構(gòu)建親緣關系圖(圖1)。從聚類分析圖可以得出：53個地方桃品種分成了3組，第一組中包括大觀、江山早、加納桃、紅清水等11個品種，其中大觀和江山早的相似系數(shù)為0.96，晚熟1號桃和2號桃的相似系數(shù)為0.98，說明它們之間遺傳關系很近；第二組包括了35個品種，其中518油桃和千年紅的相似系數(shù)為1.00，即為同物異名的現(xiàn)象；第三組包括了其余的9個品種，其中新玉和東溪小仙桃的相似系數(shù)為0.94，也表現(xiàn)出了很近的親緣關系。

圖1 基于Nei的遺傳距離的Neighbor-Joining聚類分析圖

3 小結(jié)與討論

3.1 遺傳多樣性分析

雜合度的高低及等位基因數(shù)的多少是反映所選用SSR位點鑒別植物基因型能力的重要指標[17]。本研究結(jié)果表明：所選用的12個SSR引物其多態(tài)性較高，可以用于地方桃品種的鑒定和遺傳多樣性分析，另外也表明了筆者前期所收集保存的地方桃種質(zhì)資源遺傳變異較為豐富。

12對引物在所有樣品中等位基因的平均值為7.917，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為3.399，平均觀察雜合度(Ho)為0.657，期望雜合度(He)的平均值為0.678，與史紅麗等[21]的研究結(jié)果相似(Ne=3.4)，比Ghaffari等[22]在扁桃上的研究結(jié)果稍低(Na=8.8，Ho=0.7，He=0.79)、但顯著高于Aranzana等[23]在桃上的研究結(jié)果(Na=6.6～7.3，Ho=0.35，He=0.50～0.55)。另外，本研究中桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平與杏[24](Na=3.5，Ho=0.58)、櫻桃[25](Na=3.5～6.0，He=0.49～0.66)等其他李屬植物的研究結(jié)果相比，有明顯差異，表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平。這為桃種質(zhì)資源圃的建立奠定了物質(zhì)基礎。

3.2 遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于Nei距離的Neighbor-Joining聚類分析清楚檢測到桃供試樣品的遺傳結(jié)構(gòu)：53個地方桃品種分成了3組，其中第一組中的大觀和江山早均為早熟桃品種，形態(tài)學性狀相近；晚熟1號桃和2號桃均為晚熟桃品種，形態(tài)學性狀也極其相近；另外，第一組中的加納、紅清水、上汗這3個桃品種均為日本選育的品種。第二組的518油桃和千年紅的相似系數(shù)為1.00，為同物異名的現(xiàn)象；春瑞、春雪、春蜜、突圍這4個桃均為早熟桃品種，形態(tài)學特征相似；紅蕓果、艷光、中油5號、超麗春、千年紅、京東巨油、超早油桃這幾個品種均為油桃品種，聚在一起；紅冠、夏香姬、沙紅、雪雨露這4個品種形態(tài)學特征相似，聚在一起。第三組中新玉和東溪小仙桃的相似系數(shù)為0.94，也表現(xiàn)出了很近的遺傳關系。

在不同的桃類群中，大部分遺傳關系較近的品種以及部分形態(tài)學性狀相近的品種聚在一起，說明其聚類分析結(jié)果與桃系譜以及生物學特征具有一定的關聯(lián)性，但也不是完全一致的。部分形態(tài)學性狀相差較大的桃品種，如錦繡和紅燕露、天鮮紅在聚類圖中聚集在一起，說明這3個桃品種之間的基因型存在相互滲透的現(xiàn)象，親緣關系較近。造成這種現(xiàn)象的原因可能是控制桃肉色性狀的基因發(fā)生了幾個堿基的變化，而通過SSR分析檢測不到堿基的微小變異，也可能與桃本身遺傳結(jié)構(gòu)相對復雜有關。

本研究結(jié)果也顯示出聚類結(jié)果與桃品種的地理分布之間存在一定相關性，如日本桃品種、部分地方品種分別較為集中的聚在一起。但也有部分來自不同地區(qū)甚至地理距離較遠的桃品種，其遺傳距離表現(xiàn)非常相近，造成這種現(xiàn)象的原因可能與品種所處的環(huán)境條件相似，或者人工干預較為相近有一定的關系。因此在選擇雜交親本時，應注重擴大地域選擇范圍，這對于提高遺傳多樣性具有明顯意義。

另外，研究還存在著普通桃和油桃聚為一類的交叉現(xiàn)象，說明各桃品種之間通過多年的自然選擇，以及雜交育種過程中基因之間相互滲透，從而形成了較為豐富的遺傳多樣性，同時通過生態(tài)條件的變化以及人工干預，形成了不同的品種(品系)類型。

本研究采用SSR標記來研究桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性，結(jié)果表明：SSR標記是一種經(jīng)濟、可靠的分子標記技術。從本研究的結(jié)論可以看出，所收集到的桃種質(zhì)資源遺傳變異較為豐富，遺傳多樣性水平較高，對今后桃種質(zhì)資源的保存和利用具有一定的參考價值。但本研究發(fā)現(xiàn)部分性狀差別較大的地方桃品種在聚類圖上聚為一類，這有待于進一步研究和論證。