涂偉鳳,張 洋,湯 潔,涂玉琴,辛佳佳,姬紅利,張南峰,張 弢

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,江西 南昌 330200;2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所,江西 南昌 330200;3.江西省油料作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330200;4.江西省中國(guó)科學(xué)院 廬山植物園,江西 廬山 332900)

蔊菜屬于十字花科蔊菜屬一年生或兩年生植物[1],全草可入藥,具有潤(rùn)肺、止咳和消炎作用[2],被廣泛用于哮喘、支氣管炎等呼吸道疾病治療,其主要的有效成分為蔊菜素和蔊菜酰胺[3-4]。蔊菜對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng),易于栽培管理,與模式植物擬南芥相比,具有發(fā)展成為新型模式植物的潛力[5-6]。由于蔊菜具有明顯的抗旱、抗病[7]、耐淹[8-10]、耐貧瘠和結(jié)實(shí)結(jié)籽能力強(qiáng)等優(yōu)良性狀,其已作為栽培油菜重要的野生近緣物種,用于改良油菜的主要農(nóng)藝性狀[11-16]。在干旱條件下,甘藍(lán)型油菜與蔊菜雜交后代的抗旱性明顯增強(qiáng)[17]。然而,在蔊菜細(xì)胞遺傳學(xué)方面的研究十分落后,嚴(yán)重限制了甘藍(lán)型油菜與蔊菜遠(yuǎn)緣雜交育種的進(jìn)程,不能夠深入探討外源遺傳物質(zhì)對(duì)油菜遺傳改良的細(xì)胞遺傳學(xué)機(jī)理以及關(guān)鍵功能基因的定位。所以,筆者采用常規(guī)壓片和染色體分型技術(shù),進(jìn)行了蔊菜體細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程觀察和中期染色體核型分析研究,以期為蔊菜的染色體組成和行為研究奠定細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ),為甘藍(lán)型油菜的遠(yuǎn)緣雜交育種和遺傳改良提供細(xì)胞遺傳學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究用于蔊菜體細(xì)胞有絲分裂中期染色體觀察與核型分析的子房壁組織材料,均采自江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔊菜自然居群內(nèi)的健康植株(見(jiàn)圖1)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 染色體制片 采用幼小雌蕊法[18],在9:00～11:00選取10株長(zhǎng)勢(shì)良好的蔊菜植株,每株分別采集3簇幼嫩花序,選取幼小花蕾,用尖頭鑷子剝離雌蕊并置于0.2% 8-羥基喹啉溶液中處理3 h。將處理后的雌蕊用純水清洗3遍,然后用吸水紙吸干雌蕊表面的水分,并置于卡諾固定液(乙醇∶乙酸=3∶1)內(nèi)保存。將經(jīng)卡諾固定液固定24 h以上的雌蕊用純水清洗3遍,然后置于1 mol/L HCl溶液內(nèi)，以60 ℃水浴解離10 min；經(jīng)常規(guī)壓片、卡寶品紅染色后觀察染色體有絲分裂進(jìn)程和中期分裂相細(xì)胞的染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)。

圖1 在自然生長(zhǎng)條件下的蔊菜植株

1.2.2 染色體核型分析 選取30張分散良好、染色體形態(tài)完整的中期分裂相細(xì)胞圖像進(jìn)行染色體計(jì)數(shù),然后利用Photoshop圖像處理軟件進(jìn)行核型分析。按照李懋學(xué)等的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行染色體分類(lèi)和描述,根據(jù)染色體的長(zhǎng)度比和臂比兩項(xiàng)指標(biāo)[19]進(jìn)行核型不對(duì)稱(chēng)程度分類(lèi)。另外,染色體類(lèi)型、相對(duì)長(zhǎng)度和臂比等指標(biāo)參考Levan等的命名系統(tǒng)[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔊菜子房壁細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程

蔊菜體細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程可以分為以下5個(gè)階段:間期、前期、中期、后期和末期。間期:間期細(xì)胞染色質(zhì)濃厚,核膜、核仁結(jié)構(gòu)清晰(圖2a)；隨著細(xì)胞發(fā)育,在核仁周?chē)纬擅黠@的亮環(huán)區(qū)(圖2b)。前期:在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)大量絲狀染色體,呈線網(wǎng)狀(圖2c)；此后染色體進(jìn)一步螺旋化,縮短變粗,核仁消失(圖2d)。中期:極面觀細(xì)胞內(nèi)染色體形態(tài)清晰,均勻散布于細(xì)胞內(nèi),此時(shí)期染色體分散比較好的細(xì)胞可用于染色體計(jì)數(shù)和核型分析(圖2e)；側(cè)面觀細(xì)胞內(nèi)染色體排列在赤道板上,紡錘體結(jié)構(gòu)明顯,可以清晰地看出多條紡錘絲牽引染色體(圖2f)。后期:所有染色體的著絲粒開(kāi)始一分為二,兩條染色單體逐漸分離(圖2g)；隨后,兩組染色單體完全分開(kāi),并向細(xì)胞兩極移動(dòng)(圖2h)。末期:兩組染色單體移動(dòng)至細(xì)胞兩極(圖2i)；細(xì)胞中央出現(xiàn)細(xì)胞板和明顯的核仁結(jié)構(gòu),并逐漸形成兩個(gè)子細(xì)胞(圖2j)。

2.2 蔊菜子房壁細(xì)胞中期分裂相核型

由于蔊菜染色體數(shù)量多,體積小,所以染色體壓片難度大,很難獲得染色體分散比較好的中期分裂相細(xì)胞。在制片過(guò)程中,選取長(zhǎng)勢(shì)健康旺盛的蔊菜植株,剝離長(zhǎng)度在1.5 mm左右的雌蕊可以獲得中期分裂相多、染色體分散較好的細(xì)胞(見(jiàn)圖3a)。通過(guò)雌蕊子房壁細(xì)胞有絲分裂中期染色體計(jì)數(shù)和形態(tài)觀察,可以得出:蔊菜染色體數(shù)量為2n=48,即24對(duì)染色體(見(jiàn)圖3b)。根據(jù)染色體長(zhǎng)度的平均值繪制出蔊菜核型模式圖(見(jiàn)圖3c)。

a為蔊菜子房壁細(xì)胞有絲分裂染色體中期分裂相; b為核型圖; c為核型模式圖。

根據(jù)Levan等的命名系統(tǒng)進(jìn)行蔊菜染色體形態(tài)指標(biāo)分析，結(jié)果詳見(jiàn)表1。從表1可以看出：蔊菜染色體的相對(duì)長(zhǎng)度范圍為1.51～2.82,屬于小染色體類(lèi)型植物；臂比范圍在1.04～4.53之間,最長(zhǎng)染色體與最短染色體比為1.87,臂比值大于2的染色體比率為0.625；蔊菜核型為2A型,屬于基本對(duì)稱(chēng)型,核型公式為2n=48=12sm+28m+6M+2st。

表1 蔊菜有絲分裂中期染色體核型分析結(jié)果

續(xù)表1：

染色體序號(hào)染色體的相對(duì)長(zhǎng)度/%長(zhǎng)臂短臂全長(zhǎng)臂比染色體類(lèi)型161.100.791.891.38m170.950.871.831.09m181.191.021.811.17m190.910.871.781.04sm200.960.791.761.21m210.940.791.741.19m220.910.871.711.04M230.880.871.671.00M240.710.601.511.19m

3 討論

染色體行為觀察與核型分析是細(xì)胞遺傳學(xué)研究中十分重要的工作。染色體計(jì)數(shù)、分類(lèi)與形態(tài)觀察是物種基因組結(jié)構(gòu)解析、起源進(jìn)化和功能基因定位的必要前提。由于蔊菜具有許多優(yōu)異性狀,已經(jīng)被成功應(yīng)用于近緣栽培物種油菜的遺傳改良。通過(guò)蔊菜與油菜遠(yuǎn)緣雜交,可以明顯提高油菜的抗旱耐濕能力。但是,蔊菜細(xì)胞遺傳學(xué)研究的相對(duì)落后,嚴(yán)重限制了其遠(yuǎn)緣雜交后代中外源染色體(片段)鑒定和控制相關(guān)農(nóng)藝性狀的功能基因定位。

本研究通過(guò)幼小雌蕊法,詳細(xì)地觀察了蔊菜體細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程與染色體結(jié)構(gòu)。根據(jù)Limade-Faria的標(biāo)準(zhǔn)[21],蔊菜屬于典型的小染色體植物,即所有染色體長(zhǎng)度均在1～4 μm范圍內(nèi)。與十字花科其它屬植物[22-24]相比,蔊菜染色體表現(xiàn)出明顯的數(shù)量多、長(zhǎng)度小的特點(diǎn)。另外,蔊菜染色體絕對(duì)長(zhǎng)度均在1.19～2.41 μm范圍內(nèi),長(zhǎng)度變異相對(duì)較小。所以,蔊菜染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和精細(xì)分類(lèi)比較困難,在今后的蔊菜細(xì)胞遺傳學(xué)研究中,需要進(jìn)一步發(fā)展Giemsa染色體分帶技術(shù)[25]和染色體熒光原位雜交技術(shù)[26],以便快速有效地實(shí)現(xiàn)蔊菜染色體結(jié)構(gòu)可視化與精確鑒定。在植物遠(yuǎn)緣雜交理論研究中,通過(guò)熒光原位雜交技術(shù)可以追溯雜交后代的起源、染色體組成以及不同來(lái)源染色體間的交換與互作[27-29]。