李國(guó)烈,覃明麗,蘇 旭,杜 鑫,蔣金芳,何沛蓉,何家國(guó)
(南充農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心,四川 南充 637000)
醚菌酯化學(xué)名稱(chēng)為(E)-2-甲氧亞氨基-[2-(鄰甲基苯氧基甲基)苯基]乙酸甲酯,屬于甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑,具有高效、廣譜、低毒等特點(diǎn),其作用機(jī)理在于阻斷真菌產(chǎn)生ATP,使真菌停止生長(zhǎng)或受到抑制。醚菌酯主要用于防治卵菌綱、藻菌綱、子囊菌綱、半知菌綱的真菌病害,現(xiàn)已被廣泛用于防治草莓白粉病和黃瓜白粉病等病害[2-6]。目前國(guó)內(nèi)外醚菌酯殘留分析方法主要包括液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等、氣相色譜法[9-12]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-14]。醚菌酯在草莓中的殘留檢測(cè)方面,李輝等[15]報(bào)道了采用氣相色譜法測(cè)定醚菌酯在草莓中的殘留,他們使用丙酮提取,二氯甲烷萃取,弗羅里硅土層析柱凈化,氣相色譜儀石英毛細(xì)管柱分析,外標(biāo)法定量。最終得出在0.006和1.000mg/kg添加水平下(5個(gè)平行),平均回收率分別為88.19%和92.02%,回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7.76%和7.47%。趙爾成等[16]報(bào)道了采用氣相色譜-質(zhì)譜儀測(cè)定草莓中醚菌酯的殘留,他們采用乙腈提取,PSA和無(wú)水硫酸鎂凈化,氣相色譜-質(zhì)譜儀DB-5 MS色譜柱分析。最終指出該方法的檢出限為0.05mg/kg,并且在0.05和0.5mg/kg添加水平下(5個(gè)平行),醚菌酯的回收率在85.3%~104.5%,平均為97%和92%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.8%和7.3%。到目前為止,尚未見(jiàn)報(bào)道采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定醚菌酯在草莓中的殘留。本試驗(yàn)建立了草莓中醚菌酯殘留檢測(cè)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法(UPLC-MS/MS),以期為進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和監(jiān)測(cè)食品安全提供技術(shù)參考。
1.1 試驗(yàn)藥品和試劑 醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所(編號(hào):SB-212-2008),甲醇、乙腈,甲苯,甲酸均為色譜級(jí),購(gòu)自Fisher公司。
1.2 儀器和設(shè)備 超高效液相色譜-質(zhì)譜儀(Waters,UPLC-TQS),色譜柱(Waters,Xbridge C18,3.5μm 3.0×50mm),超純水儀(Millipore,Milli-Q),旋渦混合器(IKA,Vortex Genius 3),勻漿機(jī)(IKA,T25),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮,RE-2000A),固相萃取小柱(Agilent,CARB/NH2500mg/6mL),固相萃取裝置(Agilent)以及微孔濾膜(津騰,PTFE 0.22μm)等。
1.3 樣品前處理 準(zhǔn)確稱(chēng)取勻漿后的草莓樣品25.00g于250mL三角瓶中,加入50.00mL乙腈,用勻漿機(jī)高速勻漿2min后用濾紙過(guò)濾,濾液收集到裝有10g氯化鈉的100mL具塞量筒中,蓋上塞子,劇烈震蕩1min,在室溫下靜置30min,移取出上清液10.00mL待凈化。
1.4 樣品凈化 將移取的10.00mL提取液加入已經(jīng)過(guò)5 mL乙腈+甲苯(3∶1,V/V)預(yù)淋洗ProElut CARB/NH2柱(500mg/6mL),收集淋洗液,再用25mL乙腈+甲苯(3∶1,V/V)分5次洗脫,合并淋洗液,于40℃水浴鍋蒸發(fā)近干,用5.00mL 70%甲醇定容,過(guò)0.22μm濾膜,待檢測(cè)。
1.5 超高效液相色譜-質(zhì)譜條件 流動(dòng)相采用甲醇,乙腈和含有0.1%甲酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫,洗脫程序(表1),流動(dòng)相使用前用超聲波脫氣。柱溫:40℃,進(jìn)樣量:3.0μL。質(zhì)譜采用電噴霧離子源正離子模式(ESI+),多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式進(jìn)行采集,相關(guān)參數(shù)(表2)。
表1 流動(dòng)相及梯度洗脫條件
表2 測(cè)定醚菌酯在草莓中殘留的質(zhì)譜參數(shù)
1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢測(cè)限 分別取一定量的醚菌酯標(biāo)品溶液用草莓空白基質(zhì)配制成濃度為0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00和50.00μg/L的標(biāo)準(zhǔn)液,采用1.5儀器條件進(jìn)行分析,以醚菌酯定量離子的峰面積為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),并進(jìn)行回歸分析求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)采用Masslynx V4.1軟件繪制。檢測(cè)限采用在最低濃度附近添加一系列已知濃度的雙份樣品進(jìn)行測(cè)定,采用Masslynx V4.1軟件計(jì)算醚菌酯的信噪比(S/N),以S/N≥3時(shí)的樣品濃度為方法檢測(cè)限[17]。
1.7 加標(biāo)回收和精密度 取草莓空白樣品,根據(jù)高、中、低3個(gè)濃度分別加入相應(yīng)的醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)濃度水平做6個(gè)平行質(zhì)控樣品。所有樣品按1.3和1.4進(jìn)行樣品前處理,采用1.5儀器條件測(cè)定藥物濃度,計(jì)算方法的加標(biāo)回收。精密度試驗(yàn)采用加入法。取草莓空白樣品,根據(jù)高、中、低3個(gè)濃度分別加入相應(yīng)的醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)濃度水平做6個(gè)平行。所有樣品按1.3和1.4進(jìn)行樣品前處理,采用1.5儀器條件測(cè)定藥物濃度,連續(xù)測(cè)定3d,根據(jù)隨行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品的實(shí)測(cè)濃度,即可求得方法的日內(nèi)和日間精密度。
1.8 基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率和方法過(guò)程效率 采用Matuszew ski等[18]提出的方法,比較不同條件下的峰面積平均值。在純的醚菌酯標(biāo)品溶液(A),草莓樣品基質(zhì)提取后添加醚菌酯標(biāo)品(B)和草莓樣品基質(zhì)提取前添加醚菌酯標(biāo)品(C)3個(gè)條件下,分別采用高、中、低3個(gè)濃度來(lái)評(píng)價(jià)醚菌酯在草莓樣品中的基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率和過(guò)程效率,每個(gè)條件下重復(fù)測(cè)定6個(gè)樣品?;|(zhì)效應(yīng)=B/A,提取回收率=C/B,方法過(guò)程效率=C/A。
2.1 方法選擇性 該試驗(yàn)條件下,醚菌酯采用反相液相色譜分離,流動(dòng)相中加入0.1%體積分?jǐn)?shù)的甲酸來(lái)提高ESI+的離子化效率。結(jié)果表明,醚菌酯保留時(shí)間適中(5.25min),峰形及分離度良好,且可獲得較強(qiáng)的分子離子峰強(qiáng)度,草莓基質(zhì)對(duì)草莓樣品中醚菌酯的測(cè)定無(wú)干擾。醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜、草莓空白樣品圖譜、醚菌酯草莓基質(zhì)匹配標(biāo)液和草莓樣品加標(biāo)圖譜(圖1、圖2、圖3和圖4)。
圖1 醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜(0.50μg/L)圖2 草莓空白樣品圖譜圖3 醚菌酯草莓基質(zhì)標(biāo)液圖譜(0.50μg/L)圖4 草莓加標(biāo)樣品圖譜(0.50μg/L)
2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢測(cè)限 醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在質(zhì)量濃度0.50~50.00μg/L時(shí)線(xiàn)性關(guān)系良好,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為y=4.284 17×106x+228.13(R2=0.998)。以3倍基線(xiàn)噪音的藥物濃度為最低檢測(cè)限,醚菌酯在草莓中的方法檢出限(method detection limit,MDL)為0.10μg/kg。以4倍MDL為測(cè)定下限,即4倍方法檢出限濃度作為測(cè)定下限,則醚菌酯在草莓中的測(cè)定下限為0.50μg/kg[17]。
2.3 加標(biāo)回收和精密度 醚菌酯在0.50、5.00和50.00μg/kg 3個(gè)濃度的草莓添加樣品回收率
分別為95.4%、94.3%和92.2%,日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.75%、3.36%和2.57%,日間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.34%、4.24%和5.04%,(表3和表4)。表明該試驗(yàn)方法在測(cè)定草莓中醚菌酯的殘留時(shí)具有較好的準(zhǔn)確度。
表3 草莓中醚菌酯加標(biāo)回收(n=6)
表4 草莓中醚菌酯日內(nèi)精密度和日間精密度(n=6)
2.4 基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率和方法過(guò)程效率 該試驗(yàn)條件下,采用提取后加入法從3個(gè)濃度水平來(lái)評(píng)價(jià)醚菌酯在草莓樣品中的基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率和過(guò)程效率,其結(jié)果(表5)。在0.50、5.00和50.00μg/L 3個(gè)濃度水平下,醚菌酯在草莓樣品中的基質(zhì)效應(yīng)分別為(96.08±5.01)%、(93.21±1.67)%和(93.31±0.74)%,表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng),并且基質(zhì)效應(yīng)影響較?。惶崛』厥章史謩e為(95.41±3.51)%、(94.37±4.14)%和(92.19±2.11)%,相應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.69%,4.39%和2.29%,均滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則的要求[19];方法過(guò)程效率分別為(91.64±5.19)%、(87.92±2.96)%和(86.02±1.86)%,表明該試驗(yàn)方法方法過(guò)程效率較好。
表5 3個(gè)不同濃度下的信號(hào)峰面積及基質(zhì)效應(yīng)、回收率和過(guò)程效率的計(jì)算結(jié)果(n=6)
該試驗(yàn)樣品采用乙腈提取,石墨化碳黑氨基復(fù)合柱凈化,超高效液相色譜-質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)檢測(cè)醚菌酯在草莓中的殘留,該方法前處理過(guò)程操作簡(jiǎn)便,方法的選擇性好。檢測(cè)限和定量限均低于GB 2763-2016中規(guī)定醚菌酯在草莓中的最大限量值(2 mg/kg)[20],回收率、精密度和提取回收率均滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則的要求。另外,通過(guò)基質(zhì)效應(yīng)的結(jié)果可以得出該試驗(yàn)方法基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果沒(méi)有顯著的影響,因此,該試驗(yàn)方法也可以不采用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,以簡(jiǎn)化試驗(yàn)過(guò)程。