王珺，陳書強，張亨德，黃劍磊，李博

(空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院婦產科生殖醫(yī)學中心，西安 710038)

單基因遺傳病是一類由1個或1對等位基因的突變引起的疾病，符合孟德爾遺傳規(guī)律。雖然每種單基因遺傳病的發(fā)病率較低，但是因為其種類繁多，總體患病率并不低。目前已發(fā)現(xiàn)的單基因遺傳病有7 000多種，涉及基因3 000多個。目前大多數(shù)單基因遺傳病還缺乏有效的治療方法，致死率、致殘率均很高[1-2]。胚胎植入前單基因病檢測(preimplantation genetic test for monogenetic，PGT-M)是一種與輔助生殖(ART)相結合的遺傳學診斷技術[3]，即在胚胎植入前進行特定的遺傳診斷，從而避免單基因病患兒出生。這為單基因病受累家庭帶來了新的希望，但通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)PGT-M技術的累積妊娠率并不高，本文將針對這一現(xiàn)象做初步探討，為PGT-M臨床遺傳咨詢提供參考。

材料與方法

一、研究對象

收集我中心2016年7月至2017年6月期間接診的PGT-M患者，共31個促排卵周期、102枚胚胎。患者平均年齡(32.4±4.1)歲。其中常染色體隱性遺傳(AR)8個周期，常染色體顯性遺傳(AD)7個周期，X連鎖隱性遺傳(XR)15個周期，X連鎖顯性遺傳(XD)1個周期。

同時收集我中心2016年7月至2017年6月期間進行胚胎植入前染色體非整倍性檢測(preimplantation genetic test for aneuploidies，PGT-A)患者[3]，90個周期，350枚胚胎?；颊咂骄挲g(31.9±4.2)歲。

患者納入標準：PGT-A：(1)復發(fā)性流產(≥3次)；(2)反復胚胎種植失敗(≥3次)；(3)不良孕產史；(4)嚴重男性不育。PGT-M：有明確單基因病致病風險?；颊吲懦龢藴剩?1)不符合上述入選標準者；(2)中途放棄檢測，導致無實驗結果者。

二、研究方法

1.胚胎活檢：PGT患者，體外受精后116～144 h，待胚胎發(fā)育到囊胚期(D5-D6)，并達到活檢標準時(4B-C+以上胚胎)，在內細胞團對側使用激光在透明帶上打一直徑6～10 μm的孔，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，待滋養(yǎng)外胚層細胞形成疝，激光法活檢5～10個細胞，PBS洗滌后，裝入預先準備好的0.2 ml EP管內。

2.胚胎擴增：使用Qiagen REPLI-g single cell kit(212768，RUBICON GENOMICS，美國)提取試劑盒，對胚胎活檢細胞進行裂解、DNA提取、全基因組預擴增及擴增。然后用QubitdsDNA HS Assay Kit(ZYKW-KY-002-2，嘉寶仁和)對全基因組DNA產物進行定量檢測。

3.胚胎植入前遺傳學檢測：本研究所有PGT檢測，均是以高通量測序技術(Next Generation Sequencing，NGS)為基礎，采用Ion PROTON進行檢測。對于PGT-A患者，采用胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒(ZYKW-X-013，嘉寶仁和)行染色體非整倍性檢測。對PGT-M患者，采用S-PGDM法：胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒/胚胎植入前單基因病檢測試劑盒(ZYKW-X-013/ZYKW-X-016，嘉寶仁和)進行染色體非整倍性及單基因異常檢測。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、兩組基本情況比較

PGT-M患者與PGT-A患者相比，在女方平均年齡、平均Gn使用量、平均Gn使用天數(shù)、平均獲卵數(shù)等方面差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，PGT-M患者染色體非整倍性胚胎占比與PGT-A患者相比無顯著性差異(P>0.05)，患者平均內膜厚度無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 PGT-M患者與PGT-A患者的基本情況比較[(-±s)，n(%)]

二、兩組患者的促排卵結果

PGT-M患者31個促排卵周期，共計獲得卵母細胞434枚，成熟卵母細胞351枚(80.88%)，形成胚胎271枚(62.44%)，最終獲得可行遺傳學診斷的囊胚102枚(23.50%)。PGT-A患者，90個促排卵周期，共計獲得卵母細胞1 393枚，成熟卵母細胞1 132枚(81.26%)，形成胚胎871枚(62.53%)，最終獲得可行遺傳學診斷的囊胚350枚(25.13%)。

三、胚胎染色體非整倍性檢測結果

本研究用于PGT-M檢測的102枚胚胎，其中94枚進行了染色體非整倍性及結構異常NGS檢測，8枚胚胎由于單基因病結果異常，未繼續(xù)進行染色體檢測。在94枚胚胎中，染色體整倍性胚胎43枚(45.74%)，染色體非整倍性胚胎51枚(54.26%)。PGT-A檢測的胚胎350枚，染色體整倍性胚胎169枚(48.29%)，染色體非整倍性胚胎181枚(51.71%)。

四、胚胎單基因病致病位點檢測結果

本研究用于PGT-M檢測的102枚胚胎，96枚胚胎進行了單基因病致病位點的檢測，6枚由于已檢測為染色體異常的胚胎而未繼續(xù)單基因致病位點檢測。在96枚胚胎中，完全正常胚胎28枚，攜帶胚胎29枚，致病胚胎37枚，無法判斷胚胎2枚。完全正常胚胎占29.17%，表型正常胚胎占59.38%。根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律，本研究所涉及的不同類型單基因病周期，96枚胚胎中，理論完全正常胚胎40.5枚，占42.19%，理論表型正常胚胎66.75枚，占69.53%。

統(tǒng)計分析結果顯示，完全正常胚胎，實際占比顯著小于理論占比(P<0.05)；表型正常胚胎，實際占比較理論占比低，但無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 PGT-M患者胚胎單基因病診斷結果及孟德爾理論預測結果[n(%)]

注：與理論完全正常相比，*P<0.05

五、PGT-M患者檢測后的有效胚胎占比情況

31個促排周期所獲得的102枚胚胎中，染色體整倍性胚胎43枚，其中有效胚胎(即表型正常胚胎，包含正常胚胎及攜帶胚胎)28枚，占27.45%，其中完全正常胚胎(不含攜帶胚胎)13枚，占12.75%。

討 論

染色體非整倍性與女性年齡、復發(fā)性流產、染色體結構異常等密切相關[4-7]。隨著女性年齡的增長，染色體非整倍性比率增加，流產率增加[5-6，8]。遺傳因素在復發(fā)性流產的誘因中占70%，染色體非整倍性異常是遺傳因素中的最主要原因[7，9]。

PGT-A主要適用于存在高度胚胎非整倍性風險的夫婦，以提高胚胎著床率及活產率，降低流產率[10]；PGT-M主要針對存在單基因病致病風險的夫婦，以減少出生缺陷，實現(xiàn)優(yōu)生。我們的檢測結果顯示，PGT-A患者囊胚染色體非整倍性占比51.71%。這與文獻報道基本一致[11-12]。PGT-M患者，均是以排除單基因病致病位點為目的，并不屬于不孕不育人群。有最新的研究報道顯示，在非不孕不育人群中，胚胎染色體非整倍性顯著低于不孕不育人群[13]。

本研究的數(shù)據(jù)顯示：PGT-M患者在平均年齡與PGT-A患者無顯著差異的條件下，PGT-M患者的整倍性胚胎(45.74%)，與PGT-A(48.29%)相比并無顯著性差異，也就是說，PGT-M患者所獲得的染色體整倍性胚胎與染色體非整倍性高發(fā)的不孕不育人群(PGT-A)水平相當，從占比上看，甚至整倍性胚胎占比更少。僅通過染色體檢測這一項，就已經淘汰掉了54.26%的胚胎，導致后續(xù)可用胚胎數(shù)驟減。分析原因，可能與Gn用量有一定關系。研究指出胚胎非整倍體形成與排卵藥物劑量相關[14-15]。發(fā)生機制可能是，在促排卵過程中，生理條件下的激素節(jié)律和穩(wěn)態(tài)發(fā)生急劇變化，增加卵母細胞形成過程中染色體的分離錯誤，最終導致受精胚胎發(fā)生染色體異常，造成流產率增高[16]。本研究顯示，雖然Gn用量在PGT-M與PGT-A之間無顯著差異，但PGT-M患者促排卵狀態(tài)已屬于非自然狀態(tài)，很可能胚胎染色體非整倍性會隨之增加，因此，這可能是PGT-M患者累積妊娠率低的可能原因之一。

在單基因病致病位點檢測中，實際檢測完全正常胚胎占比(29.17%)顯著低于孟德爾遺傳規(guī)律預測的完全無致病突變胚胎占比(42.19%)，而實際表型正常胚胎占比(59.38%)與預測值(69.53%)相比雖然無統(tǒng)計學差異，但也較預測值低大約10個百分點，這一結果并未見相關文獻報道。這意味著單基因病致病位點檢測可能會淘汰掉40%～70%的胚胎，筆者猜測這是PGT-M患者累積妊娠率低的可能原因之二。

目前，臨床醫(yī)生在PGT-M患者輔助生殖助孕之前行遺傳咨詢時，往往是以孟德爾遺傳規(guī)律為參考，估算最終可用胚胎數(shù)，對患者的臨床結局預期過高。而患者在最終選擇胚胎植入時，由于家庭壓力或心理焦慮等原因，往往又傾向于選擇完全正常的胚胎而不是表型正常的攜帶胚胎，這無疑更是雪上加霜，導致可用胚胎數(shù)再次減少。

PGT-M患者胚胎遺傳學診斷后，臨床可以使用的有效胚胎，需滿足染色體非整倍性正常且至少單基因病診斷表型正常。綜合本研究中31個周期的PGT-M胚胎檢測結果，能夠供患者選擇的染色體正常且表型正常的有效胚胎28枚，只占遺傳學檢測囊胚的27.45%，而染色體及單基因病致病位點完全正常的胚胎13枚，僅占12.75%。目前還不能準確統(tǒng)計出PGT-M患者31個促排卵周期的累積臨床妊娠率，但通過檢測結果可判斷出理論值：表型正常的胚胎存在于11個促排卵周期中，也就是說如果移植這些胚胎，最多能夠使11個周期獲得臨床妊娠，PGT累積臨床妊娠率最高為35.48%(11/31)；完全正常胚胎存在于9個促排周期中，同理推算，PGT累積臨床妊娠率最高為29.03%(9/31)。而在90個PGT-A周期中，有可用胚胎的周期81個，PGT累積臨床妊娠率最高可達90%(81/90)。根據(jù)我中心2015年至2016年數(shù)據(jù)顯示，PGT-A患者，累積臨床妊娠率為70.75%。由此可見，PGT-M患者累積臨床妊娠率遠低于PGT-A患者。

綜上所述，PGT-M患者要經歷胚胎染色體非整倍性篩查及單基因病診斷雙重篩選，使得可用胚胎驟減，最終導致累積臨床妊娠率降低。隨著檢測患者增多，統(tǒng)計數(shù)據(jù)量的增大，我們將繼續(xù)關注此類患者的累積臨床妊娠率，驗證并進一步尋找可能的形成原因，為臨床遺傳咨詢提供理論參考。