李國臻，耿亞松，楊志偉，陶林林，段新崇，王鑫鑫

(邢臺不孕不育專科醫(yī)院，邢臺生殖與遺傳?？漆t(yī)院，邢臺 054000)

隨著輔助生殖技術(shù)的成熟，胚胎學(xué)家逐漸把目光從提高妊娠率轉(zhuǎn)移到減少多胎妊娠率。減少多胎妊娠率最直接有效的辦法就是減少移植胚胎個數(shù)[1]，那么如何在減少移植胚胎個數(shù)的同時保障高的妊娠率呢？多數(shù)研究著眼于胚胎優(yōu)選和改良操作方式保證移植胚胎的優(yōu)質(zhì)化[2-4]。影響ICSI結(jié)局的因素中以卵母細(xì)胞質(zhì)量最為重要，因此模擬體內(nèi)環(huán)境以保證卵母細(xì)胞培養(yǎng)體系穩(wěn)態(tài)成為各大生殖中心的首選方案[5]。

有研究提出人類IVF實驗室中進(jìn)行配子及胚胎體外操作容易造成溫度的改變，溫度改變對于卵母細(xì)胞紡錘體的損傷是不可逆的，嚴(yán)重影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量[6]。而影響ICSI結(jié)局的因素中以卵母細(xì)胞質(zhì)量最為重要，卵母細(xì)胞紡錘體對于胞體和環(huán)境微小的改變都非常敏感[7-8]。因此如何在操作中盡可能減少環(huán)境的變化以減少對配子胚胎生長發(fā)育潛能的危險因素，成為胚胎學(xué)家最關(guān)心的話題。

本研究主要探討ICSI操作過程中兩個操作皿對妊娠結(jié)局的影響，通過比較實驗組與對照組的正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、種植率、臨床妊娠率等，探究ICSI操作的改進(jìn)方法是否行之有效，以期獲得更好的妊娠結(jié)局，逐漸減少多胚胎移植增加單胚胎移植比例。

材料與方法

一、研究對象

2016年1月至2017年7月在我中心行ICSI治療，獲卵數(shù)>6枚的363個周期；設(shè)對照組242個周期，在ICSI操作中應(yīng)用一個ICSI操作皿，每次注射5枚卵母細(xì)胞，操作皿重復(fù)使用；實驗組121個周期，應(yīng)用兩個ICSI操作皿，每注射5枚卵母細(xì)胞更換一次ICSI操作皿(若卵母細(xì)胞數(shù)小于10枚，每次注射半數(shù)的卵母細(xì)胞)，替換下來的ICSI皿置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)溫，兩個ICSI操作皿交替使用。胚胎培養(yǎng)室為(23±2)℃恒溫和40%～60%恒濕的弱光環(huán)境。

二、卵母細(xì)胞準(zhǔn)備

1.促排卵及穿刺取卵

促排卵均使用常規(guī)長方案，女方在黃體期肌肉注射促性腺激素釋放激素類似物(GnRHa)(達(dá)菲林，Ipsen Pharma Biotech，法國)，達(dá)到降調(diào)目的后，給予重組促卵泡β素(普麗康，Merck Sharp & Dohme Limited，英國)或尿促性素(樂寶得，麗珠制藥，珠海)促排卵，定期通過陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，當(dāng)1/3卵泡直徑≥1.8 cm時肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(麗珠制藥，珠海)5 000～10 000 U，36.5 h左右B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵，卵冠丘復(fù)合體置于37℃、6% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 h。

2.脫顆粒細(xì)胞

至少在取卵后1.5 h，用預(yù)熱的透明質(zhì)酸酶消化顆粒細(xì)胞，消化時間<60 s，用140 μm孔徑剝卵針反復(fù)吹打，直至將顆粒細(xì)胞完全脫離。

三、精子準(zhǔn)備

新鮮精液和凍存精液使用不連續(xù)密度梯度離心法或直接洗滌法，附睪和睪丸精子使用直接洗滌法，處理后計數(shù)精子密度和活率，放入培養(yǎng)箱中備用。

四、ICSI操作

將卵母細(xì)胞和精子分別加入到蓋有礦物油(Vitrolife，瑞典)的操作微滴(配子和胚胎處理液，Vitrolife，瑞典)中，應(yīng)用顯微操作系統(tǒng)(Nikon，日本)，用30度角ICSI針(Vitrolife，瑞典)在37℃恒溫下選擇形態(tài)正常、活力好的精子在聚乙烯毗咯烷酮尹汀(polyvinyl pyrrolidone，PVP)(LifeGlobal，美國)中制動并在卵母細(xì)胞液滴內(nèi)行穿刺注射。穿刺時使極體的方向處在6～7點或11～12點的位置，在3點鐘的位置注射精子。注射之后的卵母細(xì)胞放置在被覆礦物油的約25 μl卵裂培養(yǎng)液微滴(Vitrolife，瑞典)內(nèi)，胚胎發(fā)育第3天轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)使用抽屜式培養(yǎng)箱(Astec，日本)37℃，6% CO2下培養(yǎng)。

1.受精與胚胎觀察

顯微注射授精后16～20 h，倒置顯微鏡(Nikon，日本)下觀察卵細(xì)胞有兩個原核(2PN)為正常受精。

2.根據(jù)卵裂球數(shù)、碎片、卵裂球大小均一程度對卵裂期胚胎進(jìn)行評分，優(yōu)選胚胎原則為：ICSI后68～72 h，6個≤細(xì)胞數(shù)≤10個，卵裂球大小均勻，形態(tài)規(guī)則，透明帶完整，碎片<20%；D5或D6，采用Gardner[9]評分法進(jìn)行囊胚評分，優(yōu)選囊胚原則為：囊胚腔擴(kuò)張充滿整個胚胎，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞密集，滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)目多且均勻。

五、胚胎移植及移植后處理

取卵當(dāng)日肌肉注射黃體酮注射液(浙江仙琚)進(jìn)行黃體支持。視HCG注射日E2水平，移植日給予適量雌二醇(補(bǔ)佳樂，拜耳醫(yī)藥，德國)補(bǔ)充。在胚胎發(fā)育第3天或第5天選擇良好胚胎1～3枚移植入子宮，移植當(dāng)日開始使用黃體酮(安琪坦，博賞醫(yī)藥，法國)口服或陰道上藥進(jìn)行黃體支持。移植后14 d查血HCG確定生化妊娠，移植后28 d B超檢查，見孕囊確定臨床妊娠。

六、評價指標(biāo)

正常受精率=正常受精卵數(shù)/成熟卵母細(xì)胞數(shù)×100%；卵裂率=正常受精卵裂數(shù)/正常受精卵數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎/正常受精的卵裂胚胎總數(shù)×100%；囊胚形成率=可用囊胚數(shù)/養(yǎng)囊胚胚胎總數(shù)×100%；種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。

七、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、基本資料

2016年1月至2017年7月在我中心行ICSI治療的363個周期，分為對照組242個周期，實驗組121個周期。兩組在年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)、基礎(chǔ)FSH水平、基礎(chǔ)AMH、HCG日激素水平、不孕因素、移植日子宮內(nèi)膜厚度等方面無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者基本情況比較[(-±s)，%(n)]

二、胚胎質(zhì)量

實驗組與對照組的正常受精率、卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率之間無顯著性差異(P均>0.05)；實驗組的囊胚形成率顯著高于對照組(P<0.05)(表2)。

三、妊娠結(jié)局

移植周期中實驗組與對照組移植日子宮內(nèi)膜厚度和新鮮移植胚胎個數(shù)無顯著性差異(P均>0.05)；實驗組的新鮮周期移植種植率比對照組高，但差異無顯著性(P>0.05)；實驗組的臨床妊娠率顯著高于對照組(P<0.05)(表 3)。

表2 兩組間胚胎質(zhì)量比較[%(n)]

注：與對照組相比，*P<0.05

表3 兩組間新鮮移植妊娠結(jié)局比較[(-±s)，%(n)]

注：與對照組相比，*P<0.05

討 論

ICSI的操作時間隨著獲卵數(shù)的增加而延長，ICSI操作皿在培養(yǎng)箱外的滯留時間也會延長。雖然多數(shù)IVF實驗室培養(yǎng)箱外的操作主要在含有HEPES/MOPS緩沖體系的培養(yǎng)液中進(jìn)行，可以有效降低CO2濃度改變帶來的pH值變化，但是操作在培養(yǎng)箱外持續(xù)暴露，很可能會引起ICSI操作微滴物理和化學(xué)的不穩(wěn)定性[10]。Bavister等[12]認(rèn)為紡錘體是卵母細(xì)胞的一個重要組成部分，在分裂中起著決定細(xì)胞極性的作用。紡錘體結(jié)構(gòu)上或功能上的非生理狀態(tài)會影響細(xì)胞分裂期的染色體正常分離和移動，造成細(xì)胞分裂錯誤、染色體單倍體和多倍體的形成、非整倍體胚胎產(chǎn)生、受精卵發(fā)育異常和卵裂延遲等[11-12]。人類IVF實驗室中進(jìn)行配子及胚胎操作可能造成溫度的改變，卵母細(xì)胞紡錘體對于胞體和環(huán)境溫度的改變非常敏感[13-14]，并且溫度改變對于卵母細(xì)胞紡錘體的損傷是不可逆的，會嚴(yán)重影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量[15-16]，而卵母細(xì)胞質(zhì)量是影響ICSI結(jié)局因素中最為重要的因素。因此，溫度的改變成為影響配子胚胎生長發(fā)育潛能的關(guān)鍵因素。在本研究中使用兩個ICSI皿，通過交替使用的方法平衡和穩(wěn)定操作皿，減弱因培養(yǎng)箱外操作時間過長引起培養(yǎng)體系的改變。結(jié)果顯示ICSI操作中使用兩個操作皿可以顯著提高囊胚形成率。推測兩個ICSI操作皿的交替平衡使用可能可以通過穩(wěn)定操作微滴的溫度從而減弱因ICSI操作皿中暴露時間過長產(chǎn)生的胚胎發(fā)育潛能的危害。

綜上所述，本研究通過在ICSI操作中增加操作皿的方法顯著提高了囊胚形成率和ICSI新鮮移植周期的臨床妊娠率。我們推測培養(yǎng)箱外操作時間過長可能會引起培養(yǎng)體系溫度的改變，溫度通過影響pH值間接和直接導(dǎo)致卵母細(xì)胞紡錘體形成和解聚紊亂可能是影響囊胚形成和ICSI周期臨床妊娠率的原因。因此，ICSI操作中通過使用兩個操作皿可能可以減弱環(huán)境的不穩(wěn)定因素對于胚胎發(fā)育潛能的危害[18-20]，從而可以獲得更好的妊娠結(jié)局。