王科，龐輝，梁春梅，羅創(chuàng)才，黃海珠，周玉權(quán)，吳青燕，韋嬌

(1廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530021；2西安長安醫(yī)院)

炎癥反應(yīng)是機體對于刺激的一種免疫性防御反應(yīng)，通常情況下是有益的，是人體的自動的防御反應(yīng)，但是如果炎癥過激，也會對機體的組織產(chǎn)生損傷作用。在免疫系統(tǒng)中，巨噬細(xì)胞是人體的第一道防線，其幾乎參與人體所有的免疫應(yīng)答過程，對于識別、產(chǎn)生免疫應(yīng)答及清除侵入人體的細(xì)菌、病毒或異物，以及人體產(chǎn)生的衰老、損傷細(xì)胞和壞死組織等起重要作用[1]。異鼠李素(ISO)是一種擁有多種藥理作用的植物類黃酮化合物，結(jié)構(gòu)為3，5，7，4′-OH3′-CH3，廣泛存在于銀杏、沙棘等多種植物的花、果實和葉中，有抗心律失常、心肌缺血、缺氧、清除氧自由基，抗病毒、抗腫瘤及減少血清膽固醇水平等作用[1～5]。最近研究[4～8]報道，ISO可顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷模型的中性粒細(xì)胞浸潤，并減輕水腫。但目前針對ISO抗炎作用的文獻報道較少。本研究觀察了ISO對炎癥損傷小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖能力的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、細(xì)胞、試劑及儀器 ISO(中國科學(xué)院成都生物研究所，批號：MUST-16120110)。RAW264.7細(xì)胞(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院)。1640培養(yǎng)基、小牛血清、0.25%的胰酶-0.02%EDTA消化液(美國Gibco公司)，雙抗(美國Sigma公司)，脂多糖(LPS)、MTT(噻唑藍(lán))試劑盒(北京Solarbio公司)，一氧化氮(NO)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)，TNF-α-ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。酶標(biāo)分析儀(Thermo Labsystems公司)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，Integral 10純水儀(美國Millipore公司)，二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)，超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.2 RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)、分組及ISO給予方法 用1640培養(yǎng)基(含10%FBS)在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞。待細(xì)胞生長數(shù)量至對數(shù)生長期時，37 ℃環(huán)境下用胰酶進行消化5 min，用1640完全培養(yǎng)基洗滌，800 r/min離心5 min。細(xì)胞計數(shù)后接種于96孔板，每孔105個細(xì)胞，每組設(shè)6個復(fù)孔，總共鋪4塊板，貼壁培養(yǎng)12 h后按不同實驗?zāi)康奶幚?。所有?xì)胞分為5組，對照組用溶劑DMSO(≤0.2%)代替藥物培養(yǎng)細(xì)胞，模型組：用終濃度為10 ng/mL的LPS刺激細(xì)胞，使其產(chǎn)生炎癥反應(yīng)；低、中、高劑量組用10 ng/mL的LPS與終濃度為50、100、200 μg/mL的ISO(DMSO溶解)共同刺激細(xì)胞。

1.3 RAW264.7細(xì)胞增殖指數(shù)測算 細(xì)胞培養(yǎng)及分組參照“1.2”方法，分別在細(xì)胞培養(yǎng)12、24、36、48 h將MTT試劑加入到每個孔里，每孔50 μL，培養(yǎng)4 h后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入150 μL的二甲基亞砜，低速振蕩5 min，在570 nm波長下，用酶標(biāo)儀檢測每個孔的OD值。計算細(xì)胞增殖指數(shù)，細(xì)胞增殖指數(shù)=藥物組處理OD570 nm/對照組OD570 nm。

1.4 RAW264.7細(xì)胞NO檢測 細(xì)胞培養(yǎng)及分組參照“1.2”方法，在細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，每孔吸取上清100 μL，按照NO試劑盒說明書處理。在450 nm波長下，用酶標(biāo)儀檢測每個孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算NO分泌量。

1.5 RAW264.7細(xì)胞TNF-α檢測 細(xì)胞培養(yǎng)及分組參照“1.2”方法，在培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，取上清，按照ELISA試劑盒說明書處理。在450 nm波長下，用酶標(biāo)儀檢測每個孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算TNF-α分泌量。

2 結(jié)果

2.1 12、24、36、48 h各組細(xì)胞增殖指數(shù)比較 結(jié)果見表1。

表1 12、24、36、48 h各組細(xì)胞增殖指數(shù)比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞NO、TNF-α水平比較 結(jié)果見表2。

表2 各組細(xì)胞NO、TNF-α水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05。

3 討論

炎癥反應(yīng)是一種防御性或自身調(diào)節(jié)性反應(yīng)，它會造成患者自身組織損傷和功能紊亂。RAW264.7細(xì)胞為小鼠腹腔的一種巨噬細(xì)胞，是動物體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞和炎癥反應(yīng)中的效應(yīng)細(xì)胞，它在不同的微環(huán)境下分泌出多種不同的炎癥細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)及維持機體穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮了重要作用。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，其主要成分為脂多糖，可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化，使其產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，在抵抗病原入侵的同時也引起炎癥反應(yīng)及組織異常損傷。

ISO屬于黃酮類化合物，廣泛存在于植物界中，具有較好的抗腫瘤、降血脂、降血壓、抗氧化以及擴張冠脈等作用，在心血管系統(tǒng)疾病防治中具有廣泛的應(yīng)用前景[1～10]。近年對ISO的研究主要集中在抗腫瘤方面，而在抗炎方面研究報告很少。本研究顯示，與對照組比較，模型組細(xì)胞12、24、36、48 h細(xì)胞增殖指數(shù)增加；與模型組比較，低劑量組24、36 h及中劑量組和高劑量組12、24、36、48 h細(xì)胞增殖指數(shù)減少；與低劑量組比較，中劑量組24 h及高劑量組24、48 h細(xì)胞增殖指數(shù)減少。上述結(jié)果提示ISO可抑制炎癥損傷RAW264.7細(xì)胞增殖能力，且呈劑量依賴性，高劑量作用最大。

細(xì)胞因子是具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫的小分子反應(yīng)蛋白。在巨噬細(xì)胞被激活后，細(xì)胞因子可以分泌如IL-6、IFN-α、IL-1β等促炎癥細(xì)胞因子來調(diào)控免疫系統(tǒng)[10～15]。NO是一種細(xì)胞信號調(diào)節(jié)因子，可作為第二信使參與機體多個生理和病理疾病的過程[16]。有研究[17～19]表明，巨噬細(xì)胞可以釋放NO參與抗腫瘤、抗病毒、炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答等病理過程。NO的合成依賴于iNOS(誘導(dǎo)型一氧化氮合酶)的表達，iNOS的產(chǎn)生也受到一些促炎癥細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1β等)的調(diào)控[12～22]。于是我們推測，ISO抑制RAW 264.7細(xì)胞中NO的釋放，可能是通過抑制細(xì)胞內(nèi)iNOS的表達有關(guān)。巨噬細(xì)胞感染病菌時，釋放出的TNF-α是一種重要的促炎癥因子，能促使細(xì)胞的活化和增殖，引起局部或全身的炎癥反應(yīng)，并經(jīng)常參與自身免疫性反應(yīng)的疾病。因此，抑制TNF-α等炎癥細(xì)胞因子的分泌，可能阻礙機體炎癥病理的繼續(xù)發(fā)展[23,24]。本研究顯示，與對照組比較，模型組NO、TNF-α水平升高；與模型組比較，低劑量組NO水平及中劑量組和高劑量組NO、TNF-α水平降低；與低劑量組比較，中劑量組和高劑量組NO、TNF-α水平降低。上述結(jié)果提示，ISO可抑制炎癥損傷RAW 264.7細(xì)胞增殖能力的機制可能與抑制NO、TNF-α水平有關(guān)。

總之，ISO能抑制RAN 264.7細(xì)胞的增殖，進而抑制NO及TNF-α的分泌，從而發(fā)揮抗菌消炎作用，這可能與ISO可以抑制iNOS的表達及NF-κB信號通路的激活有關(guān)。但是這種抗菌消炎作用可能還通過其他通路發(fā)揮作用，因而要明確ISO具體的抗炎機制，還需進行進一步的藥理研究。