吳丹，張曼青，殷小平，周君，陳志穎，鮑兵

(1江漢大學附屬醫(yī)院 武漢市第六醫(yī)院，武漢 430015；2九江學院基礎(chǔ)醫(yī)學院；3九江學院附屬醫(yī)院；4上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院)

腦出血(ICH)是指原發(fā)性非外傷性腦實質(zhì)出血，臨床表現(xiàn)為頭痛、癲癇及神經(jīng)功能缺損，有較高的發(fā)病率和致死率[1,2]。ICH后繼發(fā)的腦組織損傷是影響患者預后、轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵因素[3]，而炎癥因子及自由基的瀑布式產(chǎn)生對ICH后繼發(fā)性腦損傷起決定性作用[4,5]?，F(xiàn)有的治療不能很好地控制ICH后繼發(fā)性腦損傷的發(fā)展。研究[6]發(fā)現(xiàn)，血紅素加氧酶-1(HO-1)在中樞神經(jīng)細胞(神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞)中廣泛表達，是核轉(zhuǎn)錄因子2(Nrf2)-抗氧化反應元件(ARE)信號通路下游的重要抗氧化及解毒蛋白，對ICH后繼發(fā)性腦損傷具有抗炎癥反應、減輕氧化應激損傷、抑制細胞凋亡等神經(jīng)保護作用。本研究運用HO-1的選擇性抑制劑鋅原卟啉-9(ZPP-Ⅸ)抑制HO-1表達，觀察用藥后Nrf2-ARE通路上下游蛋白Nrf2、NF-κB、TNF-α等表達的變化及神經(jīng)功能評分差異，探討HO-1對ICH灶周神經(jīng)保護作用的機制，為ICH后繼發(fā)性腦損傷治療提供新的實驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 95只普通級雄性SD大鼠，購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[證書編號:SDXK(湘)2009-0004]，質(zhì)量250～300 g。按隨機雙盲原則分成ZPP-Ⅸ組(30只)、ICH組(30只)、DMSO組(30只)、正常組(5只)。

1.2 主要試劑 ZPP-Ⅸ(50 mg ZPP-Ⅸ溶于35%DMSO，終濃度10 mg/mL，給藥劑量10 mg/kg)；DMSO一抗：Anti-Nrf2兔來源多克隆抗體，Anti-HO-1兔來源多克隆抗體，NF-κB兔來源單克隆抗體，TNF-α兔來源單克隆抗體，Anti-CD-11b兔來源多克隆抗體，β-actin兔抗大鼠單克隆抗體(70-Mab1445)；二抗：羊抗小鼠多克隆抗體帶Cy3熒光素，羊抗兔多克隆抗體帶FITC熒光素；Odyessy二抗(1∶15 000)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒；DAPI染色試劑；硝酸纖維素膜(NC膜，0.45 μm)；BCA試劑盒；蛋白酶抑制劑cocktail；上樣緩沖液。

1.3 ICH模型制備及ZPP-Ⅸ給予方法 參照文獻[7]的方法將ZPP-Ⅸ組、ICH組、DMSO組大鼠于腦立體定位儀上緩慢注射自體股動脈血50 μL至基底節(jié)區(qū)，制備ICH模型；正常組大鼠于相同部位打孔進針，不注血。參照Gareia18分測評法[8]，將神經(jīng)功能缺陷評分≥3分及腦切片中有明顯的圓形、橢圓形或不規(guī)則的血腫存在定義為模型制備成功標準；血液沿針道反流、流入腦室或死亡者均剔除，剔除后補充相當數(shù)量并制模成功的大鼠。ZPP-Ⅸ組在制模后30 min內(nèi)腹腔注射10 mg/kg ZPP-Ⅸ[9]，DMSO組給予10 mg/kg的35%DMSO，正常組、ICH組均給予等量生理鹽水。

1.4 大鼠神經(jīng)功能評價 采用Gareia18分測評法評價制模前24 h及制模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d大鼠神經(jīng)功能，共分為6項，即自發(fā)活動、輕癱試驗、前肢運動、加強運動功能、痛覺、深感覺，神經(jīng)功能缺損最嚴重計0分，無神經(jīng)功能缺損計18分。

1.5 大鼠腦組織Nrf2、binding-Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白檢測 取各組大鼠，于制模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d麻醉開胸，迅速暴露心臟，從左心室插管至主動脈根部，在右心耳剪開一小口做出口，4 ℃生理鹽水200 mL灌注后至流出液體清亮，換4%多聚甲醛灌注固定至老鼠肢體僵硬；斷頭取腦，腦組織迅速放入液氮(-80 ℃)中速凍，最后用錫紙包好保存于-80 ℃冰箱中備用。將大腦從-80 ℃冰箱中取出，迅速取血腫灶周3 mm腦組織，采用Western blotting法檢測Nrf2、binding-Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白。最后紅外線雙色激光成像分析機掃描NC膜后得到的圖像，用Odyessy Version3.0軟件分析，計算目的蛋白與β-actin灰度值比值。

1.6 大鼠腦組織Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α mRNA檢測 大鼠處死以及標本獲取方法同“1.5”，采用RT-PCR法檢測制模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d腦組織Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α mRNA。

1.7 大鼠腦組織Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α與小膠質(zhì)細胞(CD11b標記)共染陽性細胞數(shù)計數(shù) 大鼠處死以及標本獲取方法同“1.5”，大鼠大腦從-80 ℃冰箱取出，在預冷的多聚甲醛中固定20～30 min，再行切片(5 μm)，然后采用免疫熒光雙標法檢測Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白與小膠質(zhì)細胞共表達情況。Optpro成像分析系統(tǒng)掃描、圖像分析。取ICH灶周范圍內(nèi)觀察在200倍視野下計數(shù)5個不重復視野，得出5個視野的平均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時點神經(jīng)功能評分比較 結(jié)果見表1。

表1 各組不同時點神經(jīng)功能評分比較(分，

注：與正常組比較，*P<0.05；與ICH組比較，△P<0.05；與DMSO組比較，▲P<0.05。

2.2 各組制模后不同時點binding-Nrf2、Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白表達比較 結(jié)果見表2。

表2 各組制模后不同時點binding-Nrf2、Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白灰度值比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與ICH組比較，△P<0.05；與ZPP-Ⅸ組比較，▲P<0.05。

2.3 各組制模后不同時點Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α mRNA表達比較 結(jié)果見見表3。

表3 各組制模后不同時點Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α mRNA表達比較(灰度值，

注：與正常組比較，*P<0.05；與ICH組比較，△P<0.05。

2.4 各組制模后不同時點Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白與CD11b共染陽性細胞數(shù)比較 結(jié)果見表4。

表4 各組制模后不同時點Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白與CD11b共染陽性細胞數(shù)比較(個，

注：與ZPP-Ⅸ組比較，△P<0.05。

3 討論

ICH后眾多因素參與了繼發(fā)性腦損傷的形成，其中灶周炎癥反應與炎癥因子的釋放被認為是造成繼發(fā)性腦損傷的主要原因。Nrf2-ARE信號通路是內(nèi)生的重要的抗氧化、抗炎癥反應的通路[10]，HO-1是其下游重要的抗氧化蛋白，調(diào)控其表達是否會影響其上游的激活，目前暫沒有研究報道。ZPP-Ⅸ作為HO-1選擇性抑制劑，被廣泛用于Nrf2-ARE-HO-1信號通路的離體、在體研究[11,12]。

本課題小組前期及既往研究[10,13]發(fā)現(xiàn)，Nrf2的激活劑萊菔硫烷可抑制炎癥反應，減輕神經(jīng)功能損傷，提高下游抗氧化蛋白(如HO-1、NQO-1等)的表達，減輕ICH灶周水腫，提高神經(jīng)保護作用。在體研究[11]發(fā)現(xiàn)ICH后HO-1表達上調(diào)的時間點與Nrf2激活的時間點具有高度一致性，進一步說明HO-1是Nrf2下游的一重要蛋白[14]。回顧研究結(jié)果[6,15,16]，HO-1對中樞神經(jīng)系統(tǒng)眾多疾病均具有保護作用。而其在ICH中的作用存在廣泛爭議。表現(xiàn)出的作用與其表達的部位及作用的時間點有關(guān)。在神經(jīng)內(nèi)皮細胞中表達的HO-1具有較明確的神經(jīng)保護作用，而在膠質(zhì)細胞中的HO-1可能具有神經(jīng)保護作用，但目前證據(jù)不足。且HO-1在ICH早期具有神經(jīng)保護作用，在晚期可能表現(xiàn)出神經(jīng)毒性作用，但并沒有確切地指出具體時間點。本研究與研究[17～20]大體方向一致，但更確切地闡述了一些關(guān)鍵問題。

本研究顯示，與正常組比較，ICH組、ZPP-Ⅸ組、DMSO組制模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d神經(jīng)功能評分減少，證明DMSO作為ZPP-Ⅸ溶劑不會加重ICH后神經(jīng)功能障礙；與ICH組比較，ZPP-Ⅸ組12 h、24 h、48 h、72 h、7 d的神經(jīng)功能評分減少，說明ZPP-Ⅸ具有神經(jīng)毒性作用，可加重ICH后神經(jīng)功能障礙。本研究還顯示，與正常組比較，ICH組、DMSO組、ZPP-Ⅸ組各時間點HO-1、Nrf2、NF-κB、TNF-α蛋白表達均增加，binding-Nrf2蛋白水平減少，證實ICH后一方面啟動抗炎性、抗氧自由基通路的活化，即通過促進Nrf2入核，另一方面也啟動了炎癥反應的級聯(lián)放大;與ICH組比較，ZPP-Ⅸ組12 h、24 h、48 h、72 h及7 d HO-1蛋白表達減少，binding-Nrf2、NF-κB、TNF-α表達增加，提示ZPP-Ⅸ對ICH大鼠Nrf2-ARE信號通路有抑制作用，可能是通過抑制HO-1的表達實現(xiàn)。本文從mRNA表達水平分析得出的結(jié)果基本與蛋白的結(jié)果基本一致，個別時間點有細微差異。本文研究還發(fā)現(xiàn)，與ZPP-Ⅸ組比較，ICH組制模6 h 、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d的HO-1與CD11b共表達陽性細胞增加，ICH組制模12 h 、24 h、48 h、72 h、7 d的Nrf2與CD11b共表達陽性細胞增加。說明HO-1可促進Nrf2通路的激活，雖然可一定程度促進下游炎癥因子NF-κB、TNF-α的表達，但Nrf2通路及小膠質(zhì)細胞激活后可以顯著抑制下游炎癥因子表達從而起到神經(jīng)保護作用。

總之，ZPP-Ⅸ可能是通過抑制HO-1的表達，從而抑制Nrf2的解離、入核及增加下游NF-κB、TNF-α的表達，來加劇ICH大鼠神經(jīng)功能損傷的作用。