程琪，賀鶴，朱芳嬋，李麗，楊成芳，鐘毓娟，李勇文

(桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林 541000)

長期過度飲酒會導(dǎo)致不同程度的酒精性肝病(ALD)[1]，從酒精性脂肪性肝炎演變?yōu)榫凭灾靖?，最后階段是酒精性肝硬化，是不可逆轉(zhuǎn)的，有較高的發(fā)病率和病死率[2,3]。ALD發(fā)病機制復(fù)雜，主要有酒精攝入過量、遺傳因素、營養(yǎng)不良和氧化應(yīng)激損傷等原因[4]。氧化應(yīng)激損傷在ALD的發(fā)展中起至關(guān)重要的作用，然而對于氧化損傷的有效治療藥物仍然缺乏[5]。甲基阿魏酸(MFA)是從蟬翼藤中提取的一種單體，蟬翼藤具有較強的抗菌抗炎、抗病毒、免疫增強等功能[6]。本課題組前期研究表明，MFA可抑制乙醇誘導(dǎo)的L-02細胞凋亡和大鼠肝臟脂代謝紊亂[7,8]。本研究采用酒精灌胃法制備ALD大鼠模型，同時給予MFA進行干預(yù)，觀察MFA對大鼠ALD的治療作用，并探討其可能機制，旨在為MFA用于治療ALD提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性成年SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，由桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供[實驗動物使用許可證號為SCXK(桂)2016-0050]。將大鼠飼養(yǎng)于SPF級屏障動物房內(nèi)，房間溫度(22±2)℃，相對濕度50%～60%，自由進食進水。

1.2 藥物、試劑及儀器 MFA(美國Sigma公司)。無水乙醇(AR級，汕頭市西隴化工有限公司)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測定試劑盒(桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司)；過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒(北京市天根生化科技有限公司)；RIPA裂解液(強)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強劑,南通市碧云天生物技術(shù)研究所)；兔抗B淋巴細胞瘤2相關(guān)X蛋白(Bax)、B淋巴細胞瘤2(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved-Caspase-3,上海生工生物工程股份有限公司)；β-actin抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。Model 680型酶標(biāo)儀、T100TM PCR擴增儀和Chemi Doc型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；XL-600全自動生化分析儀(德國Erba公司)。

1.3 實驗動物分組及MFA給予方法 將60只大鼠隨機分為低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型組、正常組各12只。低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型組大鼠給予酒精灌胃誘發(fā)ALD，酒精劑量先增加后減少，第1～2周為2 g/(kg·d)，第3～4周為4 g/(kg·d)，第5～6周為6 g/(kg·d)，第7～10周為8 g/(kg·d)，然后再減至2 g/(kg·d)；每天灌胃1次，連續(xù)16周。以16周后大鼠血清ALT、AST水平升高為構(gòu)建ALD模型成功。正常組大鼠只灌胃相同體積的生理鹽水。從第13周開始，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別灌胃5、10、20 mg/kg的MFA，模型組和正常組給予等體積的溶媒，1次/d，連續(xù)4周。

1.4 大鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)測算及肝臟組織病理學(xué)檢查 16周末，稱大鼠體質(zhì)量。稱重后將所有大鼠施行安樂死，收集肝臟組織，磷酸鹽緩沖液沖洗肝臟，用濾紙輕輕拭干并立即稱重，計算肝臟指數(shù)，肝臟指數(shù)(%)=肝臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×100%)。各組隨機選取3只大鼠的肝臟組織，固定位置，用中性甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片(厚5 μm)、脫蠟后，進行蘇木精-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理變化。

1.5 大鼠血清ALT、AST及肝臟組織CAT、GSH-Px、SOD、MDA檢測 每組隨機選取3只大鼠，腹主動脈采血，通過離心(3 000 r/min，4 ℃)20 min獲得大鼠的血清樣品。按照試劑盒說明書，采用生化分析儀檢測血清ALT、AST。另外，每組隨機選取3只大鼠肝臟組織(100 mg)制備肝臟組織勻漿，按照試劑盒方法檢測肝臟組織CAT、GSH-Px、SOD、MDA。

1.6 大鼠肝臟組織Bax蛋白/Bcl-2蛋白、cleaved-Caspase-3蛋白/Caspase-3蛋白相對表達量比值測算 每組隨機選取3只大鼠，固定位置取肝臟組織100 mg，放入玻璃勻漿器中。加入1 mL RIPA組織裂解液(含有5 μL磷酸酶抑制劑和10 μL蛋白酶抑制劑)，于冰上充分勻漿，裂解物置于冰上10 min，離心(13 000 r/min，4 ℃)10 min。取上清，BCA法進行蛋白定量。加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，于100 ℃煮沸5 min。12%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將PVDF膜用5 %脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗膜。用Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Caspase-3(1∶500)、cleaved-Caspase-3(1∶200)和β-actin(1∶1 000)一抗孵育，4 ℃搖床過夜。TBST洗膜除去過量的一抗，用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶8 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光法進行發(fā)光，X射線膠片顯影。膠片掃描后測定蛋白灰度值。以β-actin為內(nèi)參，計算目標(biāo)蛋白相對表達量以及Bax蛋白/Bcl-2蛋白、cleaved-Caspase-3蛋白/Caspase-3蛋白相對表達量比值。

1.7 大鼠肝臟組織Bax mRNA/Bcl-2 mRNA相對表達量比值測算 每組隨機選取3只大鼠，固定位置取肝臟組織100 mg，按照總RNA提取試劑盒(離心柱型)Simple Total RNA kit說明書提取肝臟總RNA。用核酸蛋白測定儀測定RNA含量及純度，OD260/OD280在1.8～2.0。并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Fast Quant RT kit(with gDNase)說明書逆轉(zhuǎn)錄得cDNA。查找基因序列并設(shè)計引物，Bax引物序列：5′-agacaggggcctttttgctac-3′，5′-aattcgccggagacactcg-3′；Bcl-2引物序列：5′-ggtggggtcatgtgtgtgg-3′，5′-gggttcaggtactcagtcatcc-3′；β-actin引物序列：5′-tgttaccaactgggacgaca-3′，5′-ggggtgttgaaggtctcaaa-3′。然后再進行PCR擴增，PCR反應(yīng)總體積為25 L，熱循環(huán)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，50～55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)后于72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后分別取10 L擴增產(chǎn)物和5 L DNA Marker上樣，進行2%瓊脂糖凝膠電泳。Bio-Rad自動凝膠成像分析系統(tǒng)檢測OD值，Quantity One軟件進行分析，以β-actin為參照物。計算Bax mRNA/Bcl-2 mRNA相對表達量比值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、肝重、肝臟指數(shù)比較 結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、肝重、肝臟指數(shù)比較

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，△P<0.05；與中劑量組比較，▲P<0.05。

2.2 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)比較 ①肉眼觀：正常組大鼠肝臟呈紅褐色，包膜光滑，邊緣銳利，質(zhì)地適中；模型組大鼠肝臟顏色泛白，體積增大，包膜緊張，切面油膩，邊緣變鈍；低、中、高劑量組介于正常與模型組之間，其中高劑量組肝臟外觀接近正常組。②光鏡下：正常組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，無明顯病變；模型組中央靜脈擴張，肝竇擴張，肝細胞排列紊亂，顯著腫大，邊界模糊，胞質(zhì)中充滿脂肪泡，出現(xiàn)明顯脂肪變性，同時可見炎性細胞浸潤、變性、壞死等現(xiàn)象；中、高劑量組大鼠肝臟損傷程度有明顯改善，大鼠肝細胞變性和壞死程度明顯減輕。

2.3 各組大鼠血清ALT、AST水平比較 結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清ALT、AST水平比較

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，△P<0.05；與中劑量組比較，▲P<0.05。

2.4 各組大鼠肝臟組織CAT、GSH-Px、SOD、MDA表達比較 結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠肝臟組織SOD、GSH-Px、MDA、CAT表達比較

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，△P<0.05；與中劑量組比較，▲P<0.05。

2.5 各組大鼠肝臟組織Bax蛋白/Bcl-2蛋白、Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、cleaved-Caspase-3蛋白/Caspase-3蛋白相對表達量比值比較 結(jié)果見表4。

3 討論

ALD是臨床上常見的肝臟疾病，主要是由于長時間大量飲酒所引發(fā)的肝臟損害性病變。近年來，隨著我國人民生活水平的提高，ALD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，對人們的身體健康造成嚴重危害。目前，ALD的治療尚缺乏有效的方法[9,10]，主要采取戒酒、補充營養(yǎng)及美他多辛、水飛薊賓類、S-腺苷甲硫氨酸等藥物治療[11]，治療方法非常局限，往往達不到預(yù)期效果。因此，尋找能有效治療ALD且不良反應(yīng)小的新藥尤為迫切。中草藥在預(yù)防和治療ALD方面表現(xiàn)出多靶點、低毒性、療效較為確切的優(yōu)勢，顯示出了良好的前景[12]。MFA是從中草藥蟬翼藤的根莖中提取純化后得到的一種單體[6]，我們前期研究發(fā)現(xiàn)其可以抑制乙醇和CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，且無明顯不良反應(yīng)[13,14]。酒的主要成分是乙醇，長期酗酒，乙醇及其代謝產(chǎn)物會導(dǎo)致肝損傷。眾所周知，血清轉(zhuǎn)氨酶是肝損傷的敏感標(biāo)志。Sun等[15]研究表明，乙醇可以誘導(dǎo)酒精性肝損傷小鼠血清中ALT、AST水平升高。本研究顯示，ALD大鼠體質(zhì)量明顯減輕而肝重顯著增加，因此肝臟指數(shù)增大；MFA干預(yù)后可以顯著抑制ALD大鼠肝臟指數(shù)增大。此外，ALD大鼠肝臟組織出現(xiàn)嚴重的病理改變，并且血清中ALT和AST水平顯著升高；MFA干預(yù)后可以改善肝臟酒精性病理改變，且隨著劑量增加，ALD大鼠血清中ALT、AST水平明顯降低，說明MFA具有抗ALD的作用。

表4 各組大鼠肝臟組織Bax蛋白/Bcl-2蛋白、Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、cleaved-Caspase-3蛋白/Caspase-3蛋白

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，△P<0.05；與中劑量組比較，▲P<0.05。

乙醇攝入過多會在肝內(nèi)代謝產(chǎn)生活性氧(ROS)，肝臟內(nèi)過量的ROS介導(dǎo)肝臟脂質(zhì)代謝紊亂以及肝細胞脂質(zhì)過氧化，使肝細胞膜穩(wěn)定性變差，炎癥因子釋放增多，肝細胞凋亡增加，最終導(dǎo)致ALD[16]。體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生大量MDA，與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。此外，長期酗酒導(dǎo)致肝臟中抗氧化因子如SOD、GSH-Px和CAT等酶類大量消耗，使得肝臟清除ROS能力下降，體內(nèi)氧化還原平衡被打破，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[17]。本研究顯示，MFA可顯著提高ALD大鼠肝臟中SOD、GSH-Px和CAT含量，并明顯降低MDA含量，起到對抗乙醇誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的作用，且呈劑量依賴式。

Bcl-2家族和Caspase家族在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，Bcl-2家族中Bax發(fā)揮促凋亡作用，相反Bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用，二者共同決定細胞生死[18]。Caspase-3是Caspase家族的成員之一，也是細胞凋亡的中心效應(yīng)因子。酒精引起肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)也可通過調(diào)控細胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax的表達，進而活化Caspase-3，誘導(dǎo)肝細胞凋亡[19]。本研究顯示，MFA可抑制乙醇誘導(dǎo)的ALD大鼠肝臟中Bax/Bcl-2蛋白、mRNA表達比值，抑制cleaved-Caspase3/Caspase-3蛋白表達比值，從而抑制細胞凋亡，發(fā)揮抗ALD作用。

總之，MFA對大鼠ALD有治療作用，且高劑量效果更佳，其機制可能為減輕ALD發(fā)病關(guān)鍵環(huán)節(jié)氧化應(yīng)激及細胞凋亡程度。