賈中正，蔣佳珅，沈丹丹，花燁，葛敏，周學(xué)軍

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通 226001)

細胞增殖是腦膠質(zhì)瘤的基本特征之一,評估細胞增殖已經(jīng)成為預(yù)測膠質(zhì)瘤預(yù)后的重要因素[1]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記物逐漸應(yīng)用于膠質(zhì)瘤細胞增殖的研究。Ki-67抗原是存在于增殖細胞核中的一種核蛋白，與細胞增殖密切相關(guān)；而且膠質(zhì)瘤的Ki-67增殖指數(shù)已經(jīng)被證明有助于膠質(zhì)瘤的分級診斷與預(yù)后評價[2,3]。然而，Ki-67增殖指數(shù)需要在手術(shù)或穿刺取得腫瘤標(biāo)本后進行免疫組化測算，這不僅會造成一定的損傷，而且還可能存在抽樣誤差。動態(tài)對比增強磁共振成像(DCE-MRI)作為一種無創(chuàng)的功能MRI技術(shù)，可以在術(shù)前對腦膠質(zhì)瘤患者進行檢查，而且已被證實可以用于評估膠質(zhì)瘤分級與預(yù)后[4,5]。由于DCE-MRI、Ki-67增殖指數(shù)均有助于評估膠質(zhì)瘤分級與預(yù)后，所以我們分析DCE-MRI有可能無創(chuàng)地評估膠質(zhì)瘤Ki-67增殖指數(shù)，目前相關(guān)研究鮮有報道。本研究的目的是通過對膠質(zhì)瘤DCE-MRI參數(shù)與Ki-67增殖指數(shù)進行對照分析，探討DCE-MRI定量評估腦膠質(zhì)瘤細胞增殖程度的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月～2017年12月南通大學(xué)附屬醫(yī)院收治的腦膠質(zhì)瘤患者79例，男48例，女31例；年齡14～70歲，中位年齡45歲；根據(jù)2007版世界衛(wèi)生組織(WHO)膠質(zhì)瘤分級標(biāo)準(zhǔn)[6]，其中Ⅱ級30例[低級別膠質(zhì)瘤(LGG)]和Ⅲ級8例、Ⅳ級41例[高級別膠質(zhì)瘤(HGG)]。所有患者術(shù)前均未接受任何治療，且均經(jīng)手術(shù)病理證實。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽字同意。

1.2 DCE-MRI指標(biāo)檢測方法 對每名患者在術(shù)前進行常規(guī)MRI和DCE-MRI檢查。成像應(yīng)用3.0T MR掃描儀(GE Healthcare，Milwaukee，Wisconsin)，線圈使用16通道相控陣頭顱線圈。常規(guī)MRI掃描包括橫斷面快速自旋回波(FSE)T2WI(TR/TE 3 900 ms/118 ms)、自旋回波(SE)T1WI(TR/TE 1 700 ms/24 ms)、液體衰減恢復(fù)序列(FLAIR)(TR/TE 8 000 ms/170 ms)，F(xiàn)OV 240 mm×240 mm，矩陣256×256。掃描范圍從顱底到顱頂，層厚6 mm，間隔2 mm。橫斷面常規(guī)MRI增強掃描在DCE-MRI掃描結(jié)束后進行。常規(guī)MRI的主要目的是用于初步診斷膠質(zhì)瘤以及臨床手術(shù)需要。DCE-MRI掃描：首先，橫斷面掃描5組T1-fast field echo(T1-FFE；RF-spoiled gradient echo)多翻轉(zhuǎn)角序列，翻轉(zhuǎn)角：3、6、9、12、15，掃描參數(shù)：TR 4.3 ms；TE 1.4 ms；層厚 2.8 mm，層間距1.4 mm；矩陣256×210；FOV 250 mm 250 mm。其次，在多翻轉(zhuǎn)角序列第5次采集結(jié)束后進行DCE序列掃描，經(jīng)肘靜脈注入對比劑(Gd-DTPA-BMA，Ommiscan，GE Healthcare，Oslo，Norway)，速率為4 mL/s，總量為0.1 mmol/kg[7]，在對比劑注入結(jié)束后以相同速率注入生理鹽水10 mL沖洗，掃描翻轉(zhuǎn)角12 ，其余參數(shù)同多翻轉(zhuǎn)角掃描序列。單次掃描時間7 s，共60期，DCE掃描總時間7 min。將多翻轉(zhuǎn)角序列及DCE序列所有數(shù)據(jù)傳入后處理軟件模塊(OmniKinetics，GE Healthcare，China)，選擇上矢狀竇作為標(biāo)記血管。在該軟件中選擇改良的Tofts-Kermode模型，通過運算獲得容積轉(zhuǎn)運常數(shù)(Ktrans)、血管外細胞外間隙容積比(Ve)[8]。兩位經(jīng)驗豐富的神經(jīng)放射醫(yī)師在Ktrans與Ve圖的腫瘤最高信號區(qū)域手動設(shè)置感興趣區(qū)(ROI)，ROI大小為20～40 mm2，每例膠質(zhì)瘤測量3次，選取最大的Ktrans與Ve。ROI設(shè)置時應(yīng)避免出血、壞死與正常腦血管。

1.3 Ki-67增殖指數(shù)測算方法 免疫組化采用Dako EnVision法，一抗采用Ki-67(鼠單克隆抗體，1∶100，Abcam)。所有的膠質(zhì)瘤標(biāo)本均通過臨床手術(shù)獲取。每例標(biāo)本先通過4%甲醛固定，然后石蠟包埋，切取4 μm厚切片。切片后經(jīng)過脫蠟、水化、抗原修復(fù)，然后進行染色。染色之后，先于低倍鏡(40×)下找出Ki-67抗原標(biāo)記密度“熱區(qū)”，棕褐色為Ki-67抗原染色陽性。在高倍鏡下采用CCD隨機抽取5個視野的照片，采用Motic圖像分析系統(tǒng)(version3.2,Motic China GroupCO. Ltd.)計算陽性著色面積占圖像總面積的百分比，增殖指數(shù)計數(shù)=Ki-67陽性細胞/細胞總數(shù)×100%，選取最大值。

2 結(jié)果

2.1 不同級別膠質(zhì)瘤Ktrans、Ve、Ki-67增殖指數(shù)比較 結(jié)果見表1。

表1 不同級別膠質(zhì)瘤Ktrans、Ve、Ki-67增殖指數(shù)比較

注：與HGG比較，*P<0.05。

2.2 不同級別膠質(zhì)瘤Ktrans、Ve與Ki-67增殖指數(shù)的相關(guān)性 結(jié)果見圖1，由圖1可知，HGG的Ktrans、Ve與Ki-67增殖指數(shù)均呈正相關(guān)(r分別為0.614、0.644，P均<0.05)，LGG的Ktrans、Ve與Ki-67增殖指數(shù)均無相關(guān)性(P均>0.05)。

3 討論

膠質(zhì)瘤是成人最常見的原發(fā)腦內(nèi)腫瘤，致殘率、致死率、復(fù)發(fā)率均比較高，嚴(yán)重影響患者生命與生活質(zhì)量。根據(jù)WHO腦腫瘤分級標(biāo)準(zhǔn)，膠質(zhì)瘤分為低級別(Ⅰ級、Ⅱ級)與高級別(Ⅲ級、Ⅳ級)，級別越高，惡性度越高。膠質(zhì)母細胞瘤是最常見的膠質(zhì)瘤，其腫瘤細胞增殖明顯，且具有高度侵襲性、惡性程度最高的特點[9,10]。盡管治療方法在不斷取得進步，但目前膠質(zhì)瘤的總體預(yù)后仍較差[11]。

注：圖A、B顯示HGG的Ktrans、Ve與Ki-67增殖指數(shù)呈正相關(guān)，圖C、D顯示LGG的Ktrans、Ve與Ki-67增殖指數(shù)均無相關(guān)性。

圖1不同級別膠質(zhì)瘤Ktrans、Ve與Ki-67增殖指數(shù)的相關(guān)性分析

膠質(zhì)瘤細胞增殖是其生物學(xué)行為的主要特征，細胞增殖指數(shù)是定量評估膠質(zhì)瘤生長及預(yù)后的重要標(biāo)記物[12]。Ki-67增殖指數(shù)已被認為與膠質(zhì)瘤細胞增殖密切相關(guān)，并且與膠質(zhì)瘤的鑒別診斷與預(yù)后明顯相關(guān)[13～16]。本研究顯示，HGG的Ki-67增殖指數(shù)大于LGG，說明HGG具有更明顯的腫瘤細胞增殖程度，與前期研究[17]結(jié)果一致。但是測量膠質(zhì)瘤Ki-67增殖指數(shù)需要手術(shù)或定向穿刺獲取腫瘤標(biāo)本，然后再進行免疫組織化學(xué)檢測，這不但有可能受到腫瘤發(fā)生部位或患者身體一般狀況的限制，而且也有可能由于切除不全或腫瘤異質(zhì)性而造成抽樣誤差。因此，無創(chuàng)性的細胞增殖檢測技術(shù)對于診斷和治療膠質(zhì)瘤變得尤為重要。

MRI技術(shù)作為一種無創(chuàng)的檢測手段，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的診斷與鑒別診斷。DCE-MRI作為近些年新出現(xiàn)的功能MRI技術(shù)，已經(jīng)用于膠質(zhì)瘤的研究。DCE-MRI主要成像原理是利用順磁性對比劑注入血管導(dǎo)致T1時間縮短的特性[18～20]，然后應(yīng)用動態(tài)連續(xù)成像記錄對比劑隨時間在組織中的分布情況。DCE-MRI的兩個主要參數(shù)Ktrans與Ve主要反映對比劑分子通過血管壁的能力，即血管的通透性，借此評估腫瘤血管的破壞程度，從而間接評價腫瘤的惡性程度。到目前為止，有關(guān)DCE-MRI的膠質(zhì)瘤研究絕大多數(shù)都集中于微血管生成與通透性或灌注[7,21～24]，而DCE-MRI有關(guān)膠質(zhì)瘤細胞增殖的研究很少。本研究顯示，HGG的Ktrans、Ve均大于LGG，提示膠質(zhì)瘤隨著惡性程度的增高，腫瘤細胞增殖更加明顯，同時伴隨著腫瘤微血管的通透性增加，分析原因可能是因為在HGG中腫瘤細胞增殖明顯，而現(xiàn)有的微血管不能滿足腫瘤生長需要[25]。因此，HGG需要額外新生成血管提供更多的營養(yǎng)支持與合適的微環(huán)境來滿足腫瘤細胞增殖。這些新生成的微血管分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，而VEGF可以進一步促使新血管生成而增加微血管滲漏[26]。由于膠質(zhì)瘤持續(xù)生長需要大量消耗氧，所以腫瘤逐漸出現(xiàn)缺氧，而缺氧又可以通過調(diào)節(jié)VEGF促進新血管生成[27]。因此細胞增殖與新血管生成在膠質(zhì)瘤生長過程中交替出現(xiàn)。膠質(zhì)瘤新生成的微血管通常是不成熟而且功能低下，容易引起微血管通透性增高及血腦屏障(BBB)破壞而造成微血管滲漏[28,29]。HGG在腫瘤細胞快速增殖的同時，新生微血管通透性增高與BBB的破壞均有助于Ktrans與Ve的升高。相反，在LGG中，由于細胞增殖不明顯，所以現(xiàn)有的微血管通過擴張基本能夠滿足腫瘤生長所需要的營養(yǎng)與血氧。由于LGG新生微血管很少，所以BBB比較完整，微血管滲漏也不明顯，Ktrans與Ve無明顯升高。因此，在LGG中，Ktrans與Ve不能反映腫瘤細胞的增殖程度。國內(nèi)有學(xué)者對20例膠質(zhì)瘤進行DCE-MRI檢查發(fā)現(xiàn)，Ktrans與Ki-67增殖指數(shù)呈正相關(guān)[30]。但我們的研究顯示，在HGG中Ktrans與Ki-67增殖指數(shù)呈正相關(guān)，而在LGG中并無相關(guān)性。

總之，通過DCE-MRI獲得的Ktrans與Ve不僅可以無創(chuàng)地鑒別膠質(zhì)瘤的分級診斷，而且更有助于評估HGG的細胞增殖程度，能夠為膠質(zhì)瘤的臨床診療提供重要的參考價值。本次研究還存在一定的局限性。首先由于本次研究屬于回顧性分析，所以不能做病理與影像的點對點對照，不能排除抽樣誤差的可能性，所以我們選擇測量膠質(zhì)瘤Ktrans與Ve最大值與Ki-67增殖指數(shù)最大值進行對照研究以最大程度減小誤差。其次，樣本量相對較小，尤其是僅有8例Ⅲ級膠質(zhì)瘤。因此，未來還需要繼續(xù)擴大樣本量及精準(zhǔn)測量對我們的結(jié)果進行驗證。