劉斌，韓倩倩，賈永旭，秦艷茹

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450052)

胃癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，中國是胃癌的高發(fā)國家，據(jù)中國腫瘤登記中心最新數(shù)據(jù)估計，2015年胃癌新發(fā)病例約67.9萬例，死亡病例約49.8萬例，存在發(fā)病率高、預(yù)后差、生存率低等特點，嚴(yán)重危害我國居民健康[1]。目前，尚缺乏可靠的早期檢測指標(biāo)和個體化的治療手段，研究發(fā)生發(fā)展的機制及尋找抑制發(fā)生發(fā)展傳導(dǎo)通路中新的潛在靶點是胃癌治療的關(guān)鍵。TM4SF5是含有4個跨膜結(jié)構(gòu)域的L6超家族成員之一，由2個胞外環(huán)和1個胞內(nèi)環(huán)以及N-末端和C-末端組成，因分子結(jié)構(gòu)類似于四次跨膜蛋白超家族(TM4SF)，后被歸屬于TM4SF家族[2～4]。TM4SF5含有4個跨膜結(jié)構(gòu)域，可與多種蛋白形成復(fù)合物，促進細胞增殖[5]，促進肝癌上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，即上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，調(diào)節(jié)細胞遷移和細胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[5～9]。文獻[7,10～14]報道，TM4SF5在食管癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌組織中高度表達，且與患者不良預(yù)后相關(guān)，但目前國內(nèi)尚缺乏TM4SF4在胃腺癌組織中表達水平及臨床意義的相關(guān)報道。本研究分別采用qRT-PCR法和免疫組化法檢測胃腺癌組織中TM4SF5 mRNA、蛋白表達變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1～12月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的胃腺癌患者76例，男53例，女23例；年齡35～80歲，中位年齡51歲。所有患者術(shù)前均未行任何放化療，且均經(jīng)病理證實。手術(shù)留取胃腺癌組織及癌旁正常組織各76例份。患者均知情并簽署知情同意書，且本研究符合倫理要求。

1.2 TM4SF5 mRNA檢測方法 采用qRT-PCR法。按照TRIzol試劑按說明書中步驟提取組織標(biāo)本的總RNA，用分光光度計檢測A260、A280處的吸光值和RNA含量，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟配制RT-PCR反應(yīng)體系并進行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA用雙蒸水稀釋。TM4SF5 mRNA上游引物為5′-CGCTTACTTGCGAAATGACA-3′，下游引物為5′-TTTCCTGCAATCGCCACACA-3′；GAPDH上游引物為5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，下游引物為5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′。以cDNA行qRT-PCR反應(yīng)，擴增反應(yīng)條件為：①95 ℃預(yù)變性2 min，循環(huán)1次，主要破壞DNA復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，利于引物和模板的結(jié)合；②95 ℃變性15 s，使雙鏈DNA解離為單鏈→60 ℃退火30 s，使得引物與單鏈DNA配對結(jié)合→72 ℃延伸30 s，合成DNA模板互補鏈；循環(huán)35次；③72 ℃終延伸10 min，使得PCR反應(yīng)完全，以提高擴增產(chǎn)量。采用2-ΔΔCt法計算TM4SF5 mRNA的相對表達量，每一個樣本均獨立重復(fù)實驗3次。

1.3 TM4SF5蛋白檢測方法 采用免疫組化法。將標(biāo)本蠟塊切成3 μm的切片，作免疫組化法染色，光學(xué)顯微鏡下(400倍)觀察免疫組化檢測結(jié)果。所有免疫組化結(jié)果分別由2位病理醫(yī)師在未知患者臨床資料、TNM分期、腫瘤級別的情況下閱片，結(jié)合陰性對照和陽性對照，判斷癌組織和正常組織中TM4SF5的表達定位和表達情況。染色強度：無色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕色或棕褐色計3分。陽性染色細胞數(shù)量百分比：≤5%計0分，5%<～≤25%計1分，25%<～≤50%計2分，>50%計3分。將染色強度與其對應(yīng)陽性細胞百分比相乘作為該樣本的染色分?jǐn)?shù)，運用ROC曲線確定一個最佳臨界值，染色分?jǐn)?shù)高于該臨界值，記錄為陽性表達。

2 結(jié)果

2.1 胃腺癌組織和正常組織中TM4SF5 mRNA、蛋白表達比較 胃腺癌組織、正常組織中TM4SF5 mRNA相對表達量分別為1.236±0.731、0.402±0.210，兩者比較，P均<0.05。胃腺癌、正常組織中TM4SF5蛋白陽性率分別為59.2%(45/76)、13.2%(10/76)，兩者比較，P均<0.05。

2.2 TM4SF5蛋白表達與胃腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)果見表1。由表1可知，TM4SF5蛋白表達與胃腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度相關(guān)(P均<0.05)。

表1 TM4SF5蛋白表達與胃腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

胃癌是世界第四大常見癌癥，是繼肺癌之后的第二大癌癥死亡原因，發(fā)病率和致死率居于消化系統(tǒng)腫瘤的首位[15]。根據(jù)中國胃癌流行病學(xué)登記調(diào)查，2012年全國范圍內(nèi)約有42.2萬患者為胃癌新發(fā)，死亡病例約為29.8萬例，僅次于肺癌，其發(fā)病人數(shù)占全球胃癌發(fā)病人數(shù)的42.6%，死亡人數(shù)占45%。胃腺癌是胃惡性腫瘤最常見的一種，其發(fā)生率占胃惡性腫瘤的95%，早期診斷率低，進展期胃腺癌放、化療效果不佳，對患者的預(yù)后效果判定差。

TM4SF5是跨膜4L6家族成員，含有4個跨膜結(jié)構(gòu)域，因其結(jié)構(gòu)與TM4SF類似，后被納入TM4SF家族[16]。TM4SF5可以在細胞表面形成富含tetraspanin的微區(qū)(TERMs)，TERM包含由四跨膜蛋白，生長因子受體和整聯(lián)蛋白組成的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這些復(fù)合物可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外之間的信號傳導(dǎo)，影響EMT，增強細胞的遷移和侵襲，調(diào)節(jié)控制不同的細胞功能[17,18]。有研究[19]表明，TM4SF5在肝細胞癌中呈現(xiàn)高表達，其與CD44相互作用可改變細胞骨架，細胞狹長如梭形，細胞間的聯(lián)系消失，從而促進細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。TM4SF5/CD44可通過酪氨酸激酶Src、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子、轉(zhuǎn)錄因子Twist和Bmi1通路，即通過TM4SF5/CD44/c-Src/STAT3/Twist1/Bmi1等途徑調(diào)節(jié)肝癌細胞的自我更新，如球形生長和細胞分化，從而促進腫瘤的起始和血行循環(huán)轉(zhuǎn)移[5]。因此，靶向治療信號通路中的任一環(huán)節(jié)都可能抑制癌細胞的自我更新和血行轉(zhuǎn)移。此外，TM4SF5多克隆抗體在肝癌細胞的體內(nèi)和體外實驗中發(fā)現(xiàn)，該抗體抑制癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，提示TM4SF5有望成為腫瘤治療的潛在靶點[20]。

本研究顯示，胃腺癌組織中TM4SF5 mRNA、蛋白表達水平均高于正常組織，提示胃腺癌組織中TM4SF5 mRNA、蛋白表達上調(diào)，TM4SF5表達異?？赡芘c胃腺癌的發(fā)病有關(guān)。本研究還顯示，TM4SF5蛋白表達與胃腺癌患者的性別、年齡、腫瘤最大直徑無關(guān)，而與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，說明TM4SF5具有促進胃腺癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，可能導(dǎo)致患者預(yù)后變差，由此猜測TM4SF5可能參與了胃腺癌細胞的轉(zhuǎn)移過程。TM4SF5的過度表達導(dǎo)致CD63內(nèi)化至晚期溶酶體膜，并且可能通過從細胞表面除去CD63來阻止CD63對遷移的抑制作用。TM4SF5和FAK之間的相互作用可以介導(dǎo)FAK激活，這種TM4SF5介導(dǎo)的激活過程似乎涉及細胞粘附后FAK中的構(gòu)象釋放，轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞內(nèi)FAK，c-Src和STAT3途徑的信號以調(diào)節(jié)細胞遷移和可能的ECM的產(chǎn)生，從而促進癌細胞的轉(zhuǎn)移過程[8]。

總之，胃腺癌組織TM4SF5 mRNA、蛋白表達升高，并且TM4SF5蛋白表達還與胃腺癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究結(jié)果為進一步探索胃腺癌發(fā)病機制、尋找胃腺癌早期診斷標(biāo)志物、開辟新的靶向治療途徑、改善患者生存與預(yù)后有著重要意義。鑒于目前TM4SF5基因在腫瘤中的功能機制研究較少，接下來希望通過擴大體外與體內(nèi)實驗，進一步探討TM4SF5在胃腺癌細胞中的功能與機制，為以后科學(xué)研究提供更多理論依據(jù)。