楊文娟，宋瑩，張瑞鑫，鄭文英，鄧敏

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣州 510095)

胃癌是臨床常見的腫瘤之一，全球病死率高[1]，發(fā)病年齡主要集中于40～60歲，男女比例約2∶1。早期胃癌的5年生存率是86.7%，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者5年生存率僅20%，因此早期診斷非常重要。癌癥的侵襲是各種復(fù)雜機(jī)制調(diào)節(jié)的結(jié)果，并且是胃癌高病死率的主要原因，也是臨床治療中的重要挑戰(zhàn)。原發(fā)性癌細(xì)胞經(jīng)歷了局部侵襲浸潤(rùn)，滲入血管，通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)輸送，再?gòu)难芟到y(tǒng)外溢這一系列過(guò)程達(dá)到轉(zhuǎn)移的目的[2]。迄今為止，雖然很多胃癌侵襲性的相關(guān)研究，但是胃癌侵襲性的具體機(jī)制仍然有很多未知。人黏蛋白17(MUC17)基因是一種黏蛋白基因，定位于人染色體7q22，是黏蛋白家族Mucin中的一員[3,4]。實(shí)驗(yàn)分析表明，MUC17基因主要是在消化道中表達(dá)，包括十二指腸、回腸和橫結(jié)腸等[4,5]。盡管MUC17的生理功能尚不完全清楚，但有研究表明它有抗微生物的物理屏障功能和細(xì)胞表面?zhèn)鞲械墓δ?。MUC17也可以接受細(xì)胞外的信號(hào)，轉(zhuǎn)換為信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，從而做出相對(duì)應(yīng)的表達(dá)，例如分泌其他黏蛋白產(chǎn)物到細(xì)胞外。MUC17與癌癥的發(fā)病機(jī)制也可能有關(guān)，有報(bào)道[5]顯示相較于正常胰腺或者胰腺炎組織，其在PDACs中表達(dá)明顯異常。近期文獻(xiàn)[6]報(bào)道，MUC17是PDACs淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)后相關(guān)的因素之一。本研究觀察了MUC17基因在胃癌組織、細(xì)胞中的表達(dá)及敲低MUC17基因?qū)GS細(xì)胞侵襲、增殖能力的影響，以期為找到新的胃癌新生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本、細(xì)胞、試劑及儀器 選取2013年1月～2015年12月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院保存的胃癌和癌旁組織各31例份(液氮保存)，每例標(biāo)本均詳細(xì)記錄了患者的性別、年齡、分期等，所有標(biāo)本取材前未行新輔助化療。胃癌細(xì)胞AGS、MKN45、SGC7901、BGC823和人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1保存于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所細(xì)胞庫(kù)。胰酶、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Gibcol公司，胎牛血清購(gòu)于Hyclone公司，DMSO試劑購(gòu)于Sigma-Aldrich公司，TRIzol購(gòu)于Invitrogen公司。細(xì)胞培養(yǎng)板、移液管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶以及凍存管等一次性耗材購(gòu)自潔特公司。

1.2 胃癌、正常細(xì)胞培養(yǎng) AGS、MKN45、SGC7901、GES-1、BGC823細(xì)胞培養(yǎng)條件均為90%高糖DMEM+10%胎牛血清FBS的完全培基培養(yǎng)，培養(yǎng)箱環(huán)境均為37 ℃、5%CO2，每2 d換液1次。待細(xì)胞匯合度到80%時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。

1.3 胃癌組織、細(xì)胞MUC17基因檢測(cè) 總RNA的抽提均采用TRIzol法，每5×106個(gè)細(xì)胞加入1 mL的TRIzol，室溫靜置10 min后收集于無(wú)核酶EP管中。按照5∶1的比例加入氯仿，室溫靜置10 min后在4 ℃離心機(jī)中以12 000 G/min離心，吸取最上層于新的無(wú)核酶EP管中。按照1∶1的比例加入異丙醇，充分混勻后靜置10 min，12 000 G/min室溫離心5 min，倒掉上清，沉淀用75%酒精重懸,再以7 500 G/min離心，棄掉上清，加入無(wú)核酶水溶解沉淀，得到的為總RNA，在NANO Drop中測(cè)RNA濃度，RNA保存于-80 ℃?？俁NA逆轉(zhuǎn)錄按Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TAKARA PrimeScriptTM RT Master Mix操作說(shuō)明書操作，體系為5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)2 μL，Total RNA 0.5 μ g,使用無(wú)核酶水補(bǔ)足20 μL體系；反應(yīng)條件為37 ℃、15 min，85 ℃、5 s。Real-time PCR按TAKARA SYBR?Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus)試劑盒說(shuō)明書操作，PCR反應(yīng)采用ABI 7500real-time PCR系統(tǒng)。反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，PCR Forward Primer(10 μmol)1 μL，PCR Forward Primer(10 μmol)1 μL，cDNA 1 μL，H2O up to 20 μL。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)副孔。反應(yīng)條件為兩步法：預(yù)變性95 ℃、5 min，95 ℃、10 s，65 ℃、15 s，共40個(gè)循環(huán)。退火后采集熒光信號(hào)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.4 AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的AGS細(xì)胞接種于六孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%匯合度時(shí)使用Lipofectamine2000(Thermo Fisher Scientific)將siMUC17以及對(duì)照siNC序列轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中(分別計(jì)為觀察組和對(duì)照組)，以敲低MUC17基因。將AGS siMUC17細(xì)胞記為觀察組，AGS siNC細(xì)胞記為對(duì)照組。

1.5 AGS細(xì)胞侵襲能力觀察 ①M(fèi)UC17基因：采用Western blotting法。利用總蛋白抽提試劑盒提取總蛋白，PierceTMBCA Protein Assay Kit試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取30 μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，凝膠濃縮層使用80 V恒壓，分離層改用120 V恒壓，待溴酚藍(lán)指示劑跑到了距底層1 cm處即可結(jié)束電泳。120 V恒壓冰水浴中轉(zhuǎn)膜90 min。用TBS配制5%的脫脂牛奶封閉1 h。分別加入兔抗人MUC17單克隆抗體(美國(guó)Abcam)及鼠抗人β-actin單克隆抗體(Cell Signaling Technology)。4 ℃孵育過(guò)夜，第2天使用TBST洗膜3次，每次10 min。用已稀釋的熒光二抗在室溫避光孵育2 h，使用TBST洗膜3次，每次10 min，后使用熒光自動(dòng)顯影成像。②侵襲細(xì)胞數(shù)：使用有基質(zhì)膠的Transwell chamber。往每個(gè)Transwell小室加50 μL無(wú)血清培養(yǎng)基以水化基底膜，置于37 ℃培養(yǎng)箱30 min。消化所需細(xì)胞，終止消化后離心，棄培養(yǎng)基，用PBS洗2片以去除血清影響，用含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將重懸的細(xì)胞加入Transwell小室，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。于Transwell下室加入15%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，棄上室液體，用PBS洗滌3次，甲醇固定30 min，用棉簽擦去上室細(xì)胞，加入1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗3遍。拍照，并隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。③劃痕愈合率：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的觀察組和對(duì)照組細(xì)胞，每孔2×105個(gè)種于六孔板中。待細(xì)胞匯合率達(dá)90%時(shí)，用10 μL規(guī)格移液槍槍頭對(duì)細(xì)胞進(jìn)行劃痕，寬度控制在1 mm左右。用PBS沖洗3遍，洗去因劃痕脫落的細(xì)胞及碎片。棄去PBS，每孔加入2 mL無(wú)無(wú)血清培基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，分別于8、16、24、28、32、36 h于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 AGS細(xì)胞增殖能力觀察 ①細(xì)胞增殖率：采用MTS法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS siMUC17細(xì)胞、AGS siNC細(xì)胞，種于96孔板中，每孔500個(gè)細(xì)胞，各6個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁，分別于0、1、2、3、4、5、6 d每孔加入20 μL MTS溶液，在培養(yǎng)箱里孵育2.5 h后，在多功能酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔OD490值。將所得OD490為縱坐標(biāo)，檢測(cè)時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。②形成克隆的數(shù)量：采用平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。將AGS siNC細(xì)胞和AGS siMUC17細(xì)胞分別接種于6孔板，750個(gè)細(xì)胞/孔。置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d換液1次。15 d后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1次，每孔加入400 μL甲醇，-20 ℃固定20 min。棄去甲醇，每孔加入400μL 1%結(jié)晶紫染色液，室溫染色10 min。棄去結(jié)晶紫染色液，緩慢流動(dòng)水漂洗6孔板5 min。觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織、細(xì)胞中MUC17基因相對(duì)表達(dá)量比較 胃癌、癌旁組織MUC17基因相對(duì)表達(dá)量分別為5.9±1.0、1.8±0.4，兩者比較，P<0.05。AGS、SGC7901、BGC823、MKN45、GES-1細(xì)胞中以GES-1細(xì)胞為參照，MUC17基因相對(duì)表達(dá)量分別為37.2±4.6、21.0±2.5、3.4±1.2、1.7±0.75，P均<0.05。

2.2 兩組AGS細(xì)胞MUC17蛋白表達(dá)、侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移距離比較 結(jié)果見表1。

表1 兩組AGS細(xì)胞MUC17蛋白表達(dá)、侵襲細(xì)胞數(shù)、劃痕愈合率比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3 兩組AGS細(xì)胞增殖率、克隆形成能力比較 結(jié)果見表2。

表2 兩組AGS細(xì)胞增殖率、克隆形成能力比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，病死率在所有癌癥中排第三[7]。由于早期胃癌臨床癥狀不明顯，多數(shù)發(fā)現(xiàn)已屬晚期[8]。胃癌是多因素致病的一種疾病，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)與組織化學(xué)分為腸型和彌漫型兩類[9]，世界衛(wèi)生組織根據(jù)病理特點(diǎn)將其劃分為管狀、乳頭狀、黏液性、印戒細(xì)胞癌。胃食管反流病、胃炎、幽門螺桿菌感染以及糖尿病等，都是胃癌的高危因素[10]。

既往研究[11,12]表明，Mucin是由自身組織上皮細(xì)胞合成及分泌，并在胃腸道、乳腺、胰腺等細(xì)胞表面廣泛分布及表達(dá)的高分子量的糖蛋白。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)20種Mucin基因，即MUC1、MUC2, MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC12、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17、MUC19、MUC20，MUC17是膜連接黏蛋白，由位于7號(hào)染色體的q22位點(diǎn)的MUC17基因編碼。MUC17主要表達(dá)于在十二指腸、結(jié)腸和末端回腸[13]。在上皮細(xì)胞中MUC17起到提供信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，維持空間結(jié)構(gòu)，保護(hù)細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞有抗黏附的能力從而使腫瘤細(xì)胞失去極性[14]。文獻(xiàn)[15]報(bào)道，MUC17也有維持腸上皮完整性的作用。有研究[14,16]顯示，MUC17在胰腺癌中呈低表達(dá)。

本研究顯示，與癌旁組織比較，胃癌組織MUC17基因表達(dá)升高；與GES-1細(xì)胞比較，AGS、MKN45、BGC823、SGC7901細(xì)胞MUC17基因表達(dá)升高。與對(duì)照組比較，觀察組AGS細(xì)胞MUC17表達(dá)降低，侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)減少，細(xì)胞劃痕愈合率及細(xì)胞增殖率降低，克隆形成能力減弱。這提示MUC17或?qū)⒖赡艹蔀槲赴┲委煹男掳袠?biāo)。

總之，MUC17在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，敲低MUC17表達(dá)可抑制AGS細(xì)胞的侵襲和增殖能力。關(guān)于MUC17促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的具體機(jī)制尚未明確，還需進(jìn)一步深入探究。