張 亮，盛 浩，袁 紅，趙蘭鳳，李華興*

?

熒光假單胞菌誘導(dǎo)番茄抗枯萎病的ISR研究①

張 亮1，盛 浩1，袁 紅1，趙蘭鳳2，李華興2*

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，長沙 410128；2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510642)

本文采用實時熒光定量PCR技術(shù)對熒光假單胞菌PEF-5#18誘導(dǎo)番茄系統(tǒng)性抗性(ISR)的作用機(jī)理進(jìn)行了研究，包括了誘導(dǎo)進(jìn)程中番茄根系病程蛋白基因PRs族、等重要防衛(wèi)基因以及乙烯、水楊酸、茉莉酸等誘導(dǎo)信號調(diào)控路徑的關(guān)鍵基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，尖孢鐮刀菌Forl和熒光假單胞菌PEF-5#18對番茄植株分別具有SAR和ISR誘導(dǎo)抗性能力，而在“Forl-番茄-PEF-5#18”互作模式下，番茄植株受誘導(dǎo)所產(chǎn)生的抗性則受到SAR和ISR共同作用的影響；與對照相比，F(xiàn)orl或熒光假單胞菌PEF-5#18均能誘導(dǎo)番茄病情蛋白基因PRs (、、、) 與、、等相關(guān)防衛(wèi)基因的表達(dá)進(jìn)行上調(diào)，而相關(guān)受誘導(dǎo)基因的表達(dá)程度與動態(tài)變化則與所誘導(dǎo)的SAR和ISR抗性反應(yīng)類型以及誘導(dǎo)時間有關(guān)；此外，對于調(diào)控路徑的分析結(jié)果顯示出尖孢鐮刀菌Forl對番茄SAR誘導(dǎo)抗性主要依賴于水楊酸路徑進(jìn)行調(diào)控，而熒光假單胞菌PEF-5#18對番茄ISR誘導(dǎo)抗性則主要依賴于茉莉酸和乙烯路徑來調(diào)控。

熒光假單胞菌；誘導(dǎo)系統(tǒng)性抗性；枯萎??；信號傳導(dǎo)路徑

尖孢鐮刀菌(f.sp.,)是一種危害極大的土傳病原真菌，其侵染所致的番茄枯萎病在世界范圍內(nèi)對番茄生長、作物品質(zhì)以及土壤生態(tài)質(zhì)量構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。近年來，隨著人們生態(tài)環(huán)境保護(hù)意識的增強(qiáng)，以根際促生菌為代表的微生物防控手段逐漸興起，同時其作用機(jī)理的研究亦不斷深入[2-3]。植物系統(tǒng)性獲得抗性(SAR)與誘導(dǎo)植物系統(tǒng)性抗性(ISR)是微生物介導(dǎo)植物抗性的重要防衛(wèi)機(jī)制，前者受病原菌誘導(dǎo)獲得抗性，后者受非致病微生物誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性，兩者均對寄主作物防御尖孢鐮刀菌等致病微生物的侵害具有重要意義[4]。除誘導(dǎo)源不同外，寄主植物由根際促生菌誘導(dǎo)所產(chǎn)生的系統(tǒng)性抗性(ISR)在分子信號調(diào)控路徑上也有別于植物系統(tǒng)獲得抗性(SAR)，大量研究結(jié)果表明ISR抗性主要依賴于茉莉酸(JA)/乙烯(ET)信號調(diào)控路徑，而SAR抗性則主要依賴于水楊酸(SA)途徑[5]。熒光假單胞菌是一類具有生物防控潛力的有益微生物[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌與寄主作物互作時，可誘導(dǎo)寄主作物相關(guān)防衛(wèi)基因表達(dá)上調(diào)并提高有關(guān)抗病蛋白的合成，從而強(qiáng)化寄主作物抵御病原菌侵染的能力[7]。

熒光假單胞菌PEF-5#18能有效降低由尖孢鐮刀菌引起的番茄枯萎病病情指數(shù)，保障植株健康生長，并具廣譜的土傳病害抑制潛力[8]。然而，其在“植物-病原菌-促生菌”互作模式中是否均有ISR機(jī)制以及該機(jī)制的調(diào)控路徑等機(jī)理尚不清晰。因此，筆者擬通過RT-PCR技術(shù)對“番茄--PEF-5#18”互作過程中番茄寄主相關(guān)重要防衛(wèi)基因及其路徑調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)予以監(jiān)測，以期對PEF-5#18的ISR作用機(jī)制予以揭示，也為該生防菌的深入利用提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試誘導(dǎo)菌株為熒光假單胞菌()PEF-5#18(野生型)，病原真菌為尖孢鐮刀菌f.sp.()，均存于-80 ℃。

供試番茄品種為Bonny Best(常規(guī)感病品種)。

供試土壤為健康的菜園土(0 ~ 10 cm 耕作層)，質(zhì)地砂壤，堿解氮183 mg/kg，有效磷 166 mg/kg，速效鉀 307 mg/kg，有機(jī)質(zhì)71.3 g/kg，pH 8.0。

1.2 培養(yǎng)基、引物、PCR試劑與試劑盒

LB培養(yǎng)基：LB配方培養(yǎng)基(Sigma公司)。PDB培養(yǎng)基：PDB配方培養(yǎng)基(Sigma公司)。

試劑：RadSafe染料(RadSafe公司)，SYBR green master mix (SsoFast公司)，DEPC水(Invitrogen公司)。

試劑盒：RNeasy Plant Mini植物總RNA提取試劑盒(Qiagen公司), RNeasy純化試劑盒(Qiagen公司)，SuperScript?RIII反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)。

引物：引物詳見文獻(xiàn)[9-14](Sigma公司合成)。

1.3 誘導(dǎo)試驗設(shè)計

試驗共布置 4 個處理，分別為 PEF-5#18+PEF-5#18、、清水對照。

誘導(dǎo)劑制備[15]：挑取純化后的PEF-5#18單菌落并接種于液體LB培養(yǎng)基中，于180 r/min、室溫條件下振蕩培養(yǎng)48 h，離心，生理鹽水懸浮(109cfu/ml)后與滅菌泥炭粉按1︰10比例(v︰m)混合均勻作為誘導(dǎo)劑(108cfu/ml)，備用。

Slavin和Johnson等人對合作學(xué)習(xí)的影響進(jìn)行了元分析。其中Johnson等人給出了最詳細(xì)的闡述，還列出了達(dá)到高效合作學(xué)習(xí)所需的具體方法。最有效的方法是在“Learning Together&Alone”文中強(qiáng)調(diào)的“合作，競爭性和個性化學(xué)習(xí)的有機(jī)結(jié)合?！盌.W.Johnson和R.T.Johnson還對這一特殊的合作學(xué)習(xí)方式進(jìn)行了細(xì)致的元分析。

感病土壤配制：接種病原菌()于PDB培養(yǎng)基，于24 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)120 h，雙層滅菌紗布過濾，無菌水稀釋至106cfu/ml，與健康壤土按1︰10(︰)比例混合，備用。

盆栽誘導(dǎo)試驗：每盆(直徑15 cm)含600 g感病土壤并移栽3葉1心番茄幼苗1株，每株根部包裹3 g相應(yīng)處理的誘導(dǎo)劑，以清水無菌泥炭包裹處理為對照。每個處理設(shè)15盆，5盆為1個重復(fù)。日常管理(15 h、22 ℃光照，9 h、19 ℃無光，定時澆水保持表土稍潤)。

1.4 樣品采集

分別于試驗第 1、2、3、4、5天(相同時間點)后，各處理隨機(jī)挑選 3 盆，輕輕拔離植株根部周圍土體，自來水快速沖洗，無菌紙吸干，置于液氮運輸并轉(zhuǎn)-80 ℃冰箱保存、備用。

1.5 RT-PCR基因表達(dá)監(jiān)測

模板制備：稱取0.1 g番茄根部樣品，試劑盒法提取植物總RNA，純化，分別進(jìn)行核酸儀濃度監(jiān)測與1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

反轉(zhuǎn)錄：分別以0.5 μg RNA為模板與oligo (dT12-18) 引物按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟配制20 μl反應(yīng)體系，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，備用。

RT-PCR檢測：經(jīng)CFX96實時熒光定量PCR儀檢測完成。10 μl PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：3 μl(1/10稀釋)cDNA，1 μl 0.5 μmol/L引物(F/R)，5 μl SYBR green master mix。反應(yīng)條件為：95 °C 30 s，95 °C 15 s，60 °C 30 s，72 °C延長30 s，40個循環(huán)。每次檢測均在反應(yīng)完成后再進(jìn)行一個72 ~ 95 °C的反應(yīng)溶解曲線對檢測基因的擴(kuò)增進(jìn)行單峰特異性檢驗。每個樣品的定量PCR反應(yīng)重復(fù)3次。以LeActin內(nèi)參基因表達(dá)值作參比，計算各樣品目的基因的相對表達(dá)量[16]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010、SPSS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光假單胞菌誘導(dǎo)番茄PRs(病情蛋白)基因表達(dá)

數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，與對照相比，其他處理PRs基因均受到不同程度的誘導(dǎo)表達(dá)，其誘導(dǎo)效果受處理與時間的影響(如圖1 所示)。受對番茄SAR誘導(dǎo)作用的影響，處理的與基因的相對表達(dá)量從第1 天起逐漸上調(diào)，至第5天時的相對基因表達(dá)量分別為對照基因表達(dá)量的5.40倍和5.21倍；基因從第1天起即受到誘導(dǎo)，且基因表達(dá)明顯上調(diào)并相對穩(wěn)定，其表達(dá)量維持在對照3 ~ 4倍的水平；基因僅在第1天有明顯上調(diào)(為對照組表達(dá)量的3.28倍)，隨后表達(dá)趨于微弱。

脅迫條件下，接種熒光假單胞菌處理(PEF-5#18+)的番茄PRs基因表達(dá)受到SAR和ISR雙重作用的影響。與對照相比，該處理的基因在前3天的表達(dá)上調(diào)程度不明顯，而從第4天起才逐漸明顯上調(diào)，其第5天的相對基因表達(dá)量為對照的4.80倍；基因受SAR誘導(dǎo)作用影響，相對基因表達(dá)量穩(wěn)定且維持在對照2倍左右的水平；基因在第1天起即受到誘導(dǎo)上調(diào)，但上調(diào)程度不明顯，其第5天的相對表達(dá)量最高，為對照的2.24倍；基因在第1天起即明顯上調(diào)，至第3天達(dá)到峰值(為對照的5.48倍)。

2.2 熒光假單胞菌誘導(dǎo)番茄防衛(wèi)基因表達(dá)

從圖 2 可以看出，與對照相比，各處理均能誘導(dǎo)番茄相關(guān)防衛(wèi)基因表達(dá)上調(diào)，而表達(dá)量的變化在不同處理間有不同表現(xiàn)。

(A. PR1；B. PR4；C. PR5；D. PR6，圖中小寫字母不同表示處理間差異達(dá)到P<0.05顯著水平，下圖同)

(A. GR、B. POX、C. PAL)

從第1天起，各處理的谷胱甘肽還原酶基因()表達(dá)普遍上調(diào)，其中處理的基因的表達(dá)在第3天達(dá)到峰值(為對照的3.02倍)；單接PEF-5#18處理的基因僅在第1天表達(dá)明顯，此時的相對基因表達(dá)量為對照的3.98倍，而后隨時間的延長而減弱；PEF-5#18+Forl處理的基因受誘導(dǎo)上調(diào)最為明顯，以第5天的相對表達(dá)量最高，為對照的2.42倍。

與對照相比，處理對番茄基因的誘導(dǎo)表達(dá)效果明顯，該基因在第3 天的相對表達(dá)量達(dá)到峰值，為對照的1.98 倍；單接PEF-5#18 處理可誘導(dǎo)基因表達(dá)上調(diào)，其上調(diào)程度與誘導(dǎo)時間呈正相關(guān)，第5 天峰值時的相對表達(dá)量為對照的2.63 倍；PEF-5#18+處理的基因表達(dá)上調(diào)程度較為穩(wěn)定，基本維持在對照2.30 倍左右的水平。

脅迫條件下，各處理番茄基因的相對表達(dá)量均隨誘導(dǎo)時間的延長而逐漸上調(diào)，至第5天時，處理基因的相對表達(dá)量較對照上調(diào)了4.2倍，而PEF-5#18+處理基因的相對表達(dá)量較對照上調(diào)了6.63倍；單接PEF-5#18處理基因僅在第1天表達(dá)最強(qiáng)烈(為對照的2.20倍)，而后隨誘導(dǎo)時間的延長而趨于減弱。

2.3 熒光假單胞菌誘導(dǎo)番茄系統(tǒng)性抗性(ISR)表達(dá)的信號傳導(dǎo)途徑

從圖 3 可以看出，隨誘導(dǎo)時間的延長，處理的水楊酸調(diào)控基因表達(dá)呈現(xiàn)出遞增性上調(diào)，其相對基因表達(dá)量從第1 天的2.40 倍，遞增至第5 天的7.19 倍；單接PEF-5#18 處理的基因在第 1 天表達(dá)最強(qiáng)烈，為對照的2.57 倍，而后伴隨接種時間的延長而逐漸下調(diào)，至第5 天時的上調(diào)幅度近乎微弱；PEF-5#18+處理的基因表達(dá)情況較為穩(wěn)定，其相對表達(dá)量普遍維持對照 2 倍左右的水平。

(A. 水楊酸調(diào)控路徑基因PR1a；B. 茉莉酸調(diào)控路徑基因Pin2；C. 乙烯調(diào)控路徑基因PR1b)

如圖3所示，單接PEF-5#18的茉莉酸調(diào)控基因在第1天上調(diào)最明顯，為對照的3.90倍，而后隨誘導(dǎo)時間的延長而減弱；而與對照相比，接種病原菌的各處理(與PEF-5#18+)的基因的相對表達(dá)量上調(diào)幅度均表現(xiàn)為先下降后提高，并在第5天時達(dá)到相對表達(dá)量峰值(分別為對照的4.15倍和3.43倍)。

從圖3 可以看出，處理的基因的表達(dá)僅在第1 ~ 2 天有略微上調(diào)，而第3 ~ 5 天則均未檢測出上調(diào)；而接種熒光假單胞菌的2 個處理(PEF-5#18、PEF-5#18+)的基因表達(dá)均隨誘導(dǎo)時間的延長而呈遞增性上調(diào)趨勢，其第5 天的相對基因表達(dá)量分別為對照的2.49倍和3.33倍。

3 結(jié)論

1) 接種熒光假單胞菌PEF-5#18能誘導(dǎo)番茄植株產(chǎn)生ISR抗性反應(yīng)其植株P(guān)Rs (、、、) 基因及、、等防衛(wèi)基因均被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；病原菌脅迫時，番茄寄主所受誘導(dǎo)抗性受SAR和ISR共同作用影響，各抗性基因的誘導(dǎo)表達(dá)效果和規(guī)律與SAR和ISR抗性誘導(dǎo)生物源類型及誘導(dǎo)時間有關(guān)。

2) 病原菌對番茄植株的SAR抗性誘導(dǎo)傳導(dǎo)路徑主要依賴于SA調(diào)控途徑；而接種熒光假單胞菌PEF-5#18對番茄的ISR抗性誘導(dǎo)傳導(dǎo)路徑則主要依賴于茉莉酸和乙烯調(diào)控路徑。

[1] Colla P, Gilardi G, Gullino M L. A review and critical analysis of the European situation of soilborne disease management in the vegetable sector[J]. Phytoparasitica, 2012, 40(5): 515–523

[2] 江歡歡, 程凱, 楊興明, 等. 辣椒青枯病拮抗菌的篩選及其生物防治效應(yīng)[J]. 土壤學(xué)報, 2010, 47(6): 1225-1230

[3] 文春燕, 高琦, 張楊, 等. 含PGPR菌株LZ-8生物育苗基質(zhì)的研制與促生效應(yīng)研究[J]. 土壤, 2016, 48(2): 414–417

[4] 王璐瑤, 蔣盼盼, 甘穎, 等. 解淀粉芽胞桿菌B1619誘導(dǎo)番茄防御酶活性提高和抗病相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)[J]. 中國生物防治學(xué)報, 2017, 33(2): 234–240

[5] Burketová L, Trdá L, Ott P, et al. Bio-based resistance inducers for sustainable plant protection against patho-gens[J]. Biotechnology Advances, 2015, doi: 10.1016 / j.biotechadv.2015.01.004

[6] Bolwerk A, Lagopodi A L, Wijfjes A H M, et al. Interactions in the tomato rhizosphere of twobiocontrol strains with the phytopathogenic fungusf. sp.[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2003, 16(11): 983–993

[7] Pieterse C M J, Zamioudis C, Berendsen R L, et al. Induced systemic resistance by beneficial microbes[J]. Phytopa-thology, 2014, 52(1): 347–375

[8] Zhang L, Khabbaz S E, Wang A, et al. Detection and characterization of broad-spectrum antipathogen activity of novel rhizobacterial isolates and suppression ofcrown and root rot disease of tomato[J]. Journal of Applied Microbiology, 2015, 118(3): 685–703

[9] ?ak?r B, Gül A, Yolageldi L, et al. Response tof. sp.in tomato roots involves regulation of SA-and ET-responsive gene expressions[J]. European Journal of Plant Pathology, 2014, 139(2): 379–391

[10] Sahu P P, Rai N K, Puranik S, et al. Dynamics of defense-related components in two contrasting genotypes of tomato upon infection with Tomato Leaf Curl New Delhi Virus[J]. Molecular Biotechnology, 2012, 52(2): 140–150

[11] Aimé S, Alabouvette C, Steinberg C, et al. The endophytic strainFo47: A good candidate for priming the defense responses in tomato roots[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2013, 26(8): 918– 926

[12] Van Kan J A L, Joosten M H A J, Wagemakers C A M, et al. Differential accumulation of mRNAs encoding extracellular and intracellular PR proteins in tomato induced by virulent and avirulent races of[J]. Plant Molecular Biology, 1992, 20(3): 513–527

[13] Milling A, Babujee L, Allen C.extracellular polysaccharide is a specific elicitor of defense responses in wilt-resistant tomato plants[J]. PLoS One, 2011, 6(1): e15853

[14] Tornero P, Gadea J, Conejero V, et al. Two PR-1 genes from tomato are differentially regulated and reveal a novel mode of expression for a pathogenesis-related gene during the hypersensitive response and development[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 1997, 10(5): 624–634

[15] Khabbaz S E, Abbasi P A. Isolation, characterization, and formulation of antagonistic bacteria for the management of seedlings damping-off and root rot disease of cucumber[J]. Canadian Journal of Microbiology, 2013, 60(1): 25–33

[16] Pfaffl M W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR[J]. Nucleic Acids Research, 2001, 29(9): e45–e45

Induction of Systemic Resistance and Signal Passway Regulation byPEF-5#18 AgainstWilt Disease on Tomato

ZHANG Liang1, SHENG Hao1, YUAN Hong1, ZHAO Lanfeng2, LI Huaxing2*

(1 College of Natural Resources and Environment, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2 College of Natural Resources and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

In this study,the expressions of pathogenic protein genes (PRs), defence related genes like, etc., and signal regulated key genes of SA, JA, ET passway were analyzed through RT-PCR technology in order to understand the mechanism of induced systemic resistance byPEF-5#18 on tomato. The results showed that the pathogenicandPEF-5#18 could induce tomato plant resistance by SAR or ISR, respectively, whereas, under the interaction condition of-Tomato-PEF-5#18, the joint-inducing effects from SAR and ISR affected tomato’s resistance. Compared with the control treatment,all of the PRs family (,,,) genes as well as the related defense genes (,,) were up-regulated, however, the expressing values and dynamic changes of induced genes were influenced by the SAR or ISR type and inducing time. In addition, the results implied the SAR induced bywas regulatedthrough SA singal passway, and the ISR induced byPEF-5#18 was mainly depend on JA or ET singal passway.

; Induced systemic resistance; Tomato wilt; Signal passway

廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項目(2009B090300330)資助。

(huaxli@scau.edu.cn)

張亮(1984—)，男，山西大同人，博士，講師，主要從事土壤微生物研究。E-mail: qingzhiweiwu@sina.com

10.13758/j.cnki.tr.2018.05.027

S476

A