種 岳，朱國棟，張海寶，徐 珊，王新陽，賀大林

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061)

1 材料與方法

1.1實驗材料786-O和ACHN細(xì)胞系，均購于美國ATCC細(xì)胞庫；Millicell小室(Millipore，USA)；細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning，USA)；Matrigel(BD,USA)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco，USA)；胎牛血清(杭州四季青公司，China)；0.25%胰酶(Sigma，USA)；一抗：anti-FOXP3(Abcam,ab20034)，二抗：山羊抗鼠(北京中杉金橋，ZB-2305),羊抗兔(北京中杉金橋，ZB-2301)；ECL發(fā)光液(Bio-rad，USA)。從TCGA(The Cancer Genomic Atlas)數(shù)據(jù)庫中的Human Protein Atlas子數(shù)據(jù)庫下載分析528例腎癌患者的生存預(yù)后數(shù)據(jù)。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 使用含有10%胎牛血清的1 640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，均置于37 ℃，5% CO2條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞感染 于蘇州吉瑪基因公司訂購c-FOXP3敲低慢病毒(含3個敲低序列和1個陰性對照)，分別將786-O和ACHN接種于24孔板內(nèi)，每孔4×104個細(xì)胞，完全培養(yǎng)基37℃、5% CO2過夜。用含2%胎牛血清的靶細(xì)胞維持液更換完全培養(yǎng)基并分別加入病毒10 μL，培養(yǎng)過夜后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞需要傳代時傳至6 cm培養(yǎng)皿并加入嘌呤霉素篩選(786-O 1 μg/μL；ACHN 6 μg/μL)，利用Western blot鑒定敲低效率。

1.2.3Western blot 收集細(xì)胞團(tuán)塊并用PBS清洗細(xì)胞團(tuán)塊3次，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰浴10 min，于預(yù)冷的4度離心機(jī)15 000 r/min離心15 min后收集上清，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度后加入6×上樣緩沖液并于沸水中煮5 min。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子質(zhì)量大小蛋白分離，將凝膠上蛋白連同marker轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%牛奶封閉1 h，分別加入相應(yīng)的一抗(c-FOXP3 1∶1 000;β-actin 1∶1 000; N-cadherin 1∶1 000; E-cadherin 1∶1 000; Vimentin 1∶1 000)，4 ℃搖床過夜。TBST緩沖液洗膜三次，每次10 min，孵育相應(yīng)二抗(山羊抗兔、山羊抗鼠均為1∶3 000稀釋)1 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。加入顯影液顯影。

1.2.4劃痕實驗 用marker筆在6孔板背后，用直尺均勻劃橫線，大約每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔，每孔至少穿過3條線。在每孔中接種約5×105個細(xì)胞(786-O和ACHN)，將培養(yǎng)板置于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜，第2天用微量上樣器吸頭垂至于背后的橫線劃痕，用PBS緩沖液洗細(xì)胞3次并加入無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)分別并于0、24、36、48 h取樣，拍照。

1.2.5Transwell細(xì)胞遷移實驗及侵襲實驗 分別向Millicell小室的上室加入 200 mL 786-O和ACHN細(xì)胞懸液，含4×104個細(xì)胞。向小室的下室加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基800 μL，將培養(yǎng)板置于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。取出小室，用棉簽擦去上室的細(xì)胞。PBS緩沖液洗小室3次后，將下室細(xì)胞置于4%多聚甲醛溶液中固定 10 min。再用 PBS緩沖液洗小室3次，隨后將下室置于0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min。PBS緩沖液洗去殘留結(jié)晶紫染料后置于顯微鏡下觀察。取 5個100×隨機(jī)視野計數(shù)穿膜細(xì)胞個數(shù)并計算出 5個視野的穿膜細(xì)胞平均數(shù)。侵襲實驗：將已包被Matrigel(與無血清培養(yǎng)基1∶5稀釋)的孔徑8 μm的小室置于 24 孔板的孔內(nèi)。向小室的上室加入 200 mL 786-O細(xì)胞懸液，含 8×104個細(xì)胞。向小室的下室加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基800 μL，將培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。處理方法同遷移實驗，并拍照計數(shù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，采用雙尾t檢驗比較兩組數(shù)據(jù)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1c-FOXP3表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后有關(guān)528例腎透明細(xì)胞癌患者(來自TCGA數(shù)據(jù)庫中的子庫Human Protein Atlas)分為兩組，其中183例患者低表達(dá)c-FOXP3，345例患者高表達(dá)c-FOXP3，生存分析結(jié)果示低表達(dá)c-FOXP3組的患者總生存率明顯高于高表達(dá)c-FOXP3組，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)，提示c-FOXP3表達(dá)水平低的腎透明細(xì)胞癌患者，總生存率較高。

圖1 低表達(dá)及高表達(dá)c-FOXP3的腎透明細(xì)胞癌患者的生存率比較(P<0.05)

2.2c-FOXP3敲低細(xì)胞的體外遷移能力受到抑制細(xì)胞劃痕實驗表明c-FOXP3敲低組細(xì)胞體外遷移能力較對照組減弱，Transwell小室遷移實驗證實786-O及ACHN，c-FOXP3敲低組細(xì)胞穿過小室細(xì)胞數(shù)均少于對照組，統(tǒng)計分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2、圖3)，由此推斷c-FOXP3可能促進(jìn)腎癌細(xì)胞的體外遷移能力。

2.3c-FOXP3敲低后細(xì)胞體外侵襲能力減弱Transwell小室侵襲實驗表明c-FOXP3敲低組細(xì)胞穿過小室的細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組，統(tǒng)計學(xué)分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖4)，由此推斷c-FOXP3可能促進(jìn)腎癌細(xì)胞的體外侵襲能力。

圖2 c-FOXP3在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)

A：Western blot法鑒定人腎癌786-O和ACHN細(xì)胞系中c-FOXP3存在高表達(dá)(×100)；B：Western blot法鑒定c-FOXP3敲低組細(xì)胞(KD)及對照組細(xì)胞(NC)在786-O和ACHN細(xì)胞系中c-FOXP3的敲低效率及其柱狀圖[其中ACHN的KD1 和KD2分別是兩個c-FOXP3的敲低細(xì)胞株(KD2細(xì)胞株c-FOXP3的敲低效率較高，后續(xù)實驗均使用KD2作為c-FOXP3敲低的ACHN細(xì)胞株)]。

圖3 c-FOXP3可提高腎癌細(xì)胞的體外遷移能力

A：786-O和ACHN劃痕實驗中KD、NC組細(xì)胞體外遷移能力比較及其柱狀圖(c-FOXP3敲低組細(xì)胞體外遷移能力弱于對照組P<0.05)；B：786-O和ACHN Transwell小室遷移實驗中KD、NC組細(xì)胞體外遷移能力比較及其柱狀圖(c-FOXP3敲低組體外遷移細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組，P<0.05)。

A：人腎癌細(xì)胞786-O的c-FOXP3敲低組細(xì)胞(KD)的體外侵襲能力明顯低于對照組細(xì)胞(NC)；B：柱狀圖顯示人腎癌細(xì)胞786-O的KD組細(xì)胞穿越基質(zhì)層及小室的數(shù)目明顯少于NC組(P<0.05)。

2.4c-FOXP3促進(jìn)腎癌侵襲遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)腎癌侵襲遷移相關(guān)指標(biāo)N-cadherin和Vimentin在c-FOXP3敲低的786-O和ACHN組表達(dá)水平均較對照組低(P<0.05，圖5)，由此推斷c-FOXP3可能是促進(jìn)腎癌侵襲、遷移的重要轉(zhuǎn)錄因子。

圖5Westernblot檢測間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白在c-FOXP3敲低的786-O和ACHN組(KD)及對照組(NC)細(xì)胞的表達(dá)水平及其柱狀圖

A:Western blot檢測證實間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-cadherin和Vimentin均在c-FOXP3敲低的786-O和ACHN細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)；B：柱狀圖顯示N-cadherin和Vimentin在c-FOXP3敲低的786-O和ACHN組細(xì)胞(KD)中的表達(dá)水平均較對照組細(xì)胞(NC)減低(P<0.05)。

3 討 論

KARANIKAS等[12]研究了25個不同組織來源的細(xì)胞株，包括肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、黑色素瘤、紅白血病、急性T細(xì)胞白血病等，結(jié)果發(fā)現(xiàn) c-FOXP3的mRNA和蛋白質(zhì)在所有腫瘤細(xì)胞株中均被檢測到，僅表達(dá)水平不同，而與組織來源無關(guān)。c-FOXP3在不同腫瘤發(fā)展、演進(jìn)中作用不盡相同，包括促進(jìn)腫瘤演進(jìn)，以及抑制腫瘤生長兩個方面。對非小細(xì)胞肺癌患者的組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)TNM分期較晚的患者中c-FOXP3陽性率較高，且c-FOXP3表達(dá)陽性的患者生存率明顯低于陰性組[13]。在胃癌中有報道，c-FOXP3可與NF-κB相互作用而減少NF-κB與COX-2啟動子的結(jié)合，進(jìn)而影響COX-2的表達(dá)而發(fā)揮腫瘤抑制作用[14]。WANG等[15]發(fā)現(xiàn)趨化因子CCL5可以被c-FOXP3反式激活，從而由外周血向胰腺癌腫瘤微環(huán)境中招募更多的c-FOXP3+ 的Treg細(xì)胞，促進(jìn)胰腺癌的演進(jìn)。該研究提示，癌組織中表達(dá)的c-FOXP3可能作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)趨化因子表達(dá)，進(jìn)而向腫瘤微環(huán)境中招募炎癥細(xì)胞，并促進(jìn)腫瘤的演進(jìn)。

通過對TCGA數(shù)據(jù)庫分析，我們得知c-FOXP3在腎癌中的表達(dá)量與患者預(yù)后具有明顯相關(guān)性，腎癌組織中c-FOXP3表達(dá)量相對較低的患者，臨床預(yù)后較好。通過對常見腎癌細(xì)胞株進(jìn)行c-FOXP3免疫印跡檢測，發(fā)現(xiàn)786-O、ACHN和RCC42細(xì)胞中c-FOXP3表達(dá)水平較高。我們進(jìn)而借助慢病毒感染技術(shù)建立了786-O和ACHN細(xì)胞的 c-FOXP3敲低細(xì)胞系，并進(jìn)行了一系列癌細(xì)胞體外侵襲、遷移相關(guān)的生物學(xué)檢測。細(xì)胞劃痕實驗和Transwell小室遷移實驗表明，c-FOXP3敲低組腎癌細(xì)胞的遷移能力均較對照組下降；Transwell侵襲實驗證實，c-FOXP3敲低組腎癌細(xì)胞的侵襲能力較對照組也有明顯降低。由此我們可以看出，c-FOXP3作為轉(zhuǎn)錄因子，確實對腎癌侵襲、遷移這一腫瘤生物學(xué)行為具有促進(jìn)作用。為進(jìn)一步探討分子機(jī)制，我們測定了腫瘤EMT相關(guān)蛋白標(biāo)志物的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)786-O及ACHN細(xì)胞系中，c-FOXP3敲低組細(xì)胞中N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平均較對照組降低。c-FOXP3表達(dá)水平與“上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化”(epithelial-mesenchymal transition，EMT)標(biāo)志物的表達(dá)呈現(xiàn)同一變化趨勢，提示腎癌的侵襲、遷移與c-FOXP3介導(dǎo)的EMT通路激活可能相關(guān)。

腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致惡性腫瘤患者死亡的主要原因。新生血管形成在腎癌的演進(jìn)中發(fā)揮重要作用，多項研究提示肥大細(xì)胞在腎癌組織中的浸潤數(shù)目明顯高于正常組織，腫瘤細(xì)胞分泌的多種趨化因子均可促進(jìn)肥大細(xì)胞在腫瘤局部聚集。作為腫瘤微環(huán)境中重要成分的肥大細(xì)胞，可分泌一系列具有促進(jìn)血管形成作用的活性因子，借鑒WANG等[15]的研究結(jié)果，我們認(rèn)為c-FOXP3可能作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)趨化因子表達(dá)，進(jìn)而向腫瘤微環(huán)境中招募包括肥大細(xì)胞在內(nèi)的多種炎癥細(xì)胞，并促進(jìn)腫瘤演進(jìn)。除腫瘤微環(huán)境可能影響癌癥演進(jìn)，近年來以E-cadherin等上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)及功能缺失，同時N-cadherin、 Vimentin等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)為特征的EMT在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移研究中的作用受到越來越多的關(guān)注[16-17]。根據(jù)已有的研究表明，TGF-β、Wnt/β-catenin、 Notch、Hedgehog、IL-6/STAT3以及NF-κB等信號通路可誘導(dǎo)EMT進(jìn)程。Snail1、Snail2、Twist1、Twist2、ZEB1和ZEB2等轉(zhuǎn)錄因子在EMT中發(fā)揮重要作用[18-19]。c-FOXP3作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，其在NF-ΚB信號通路中的參與提示其可能對EMT有一定貢獻(xiàn)，通過我們的實驗初步驗證了c-FOXP3通過某種機(jī)制促進(jìn)N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，從而促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌EMT進(jìn)程。這一研究提示我們，c-FOXP3可能成為促進(jìn)腎癌EMT的潛在轉(zhuǎn)錄因子，抑制c-FOXP3可能作為將來腎透明細(xì)胞癌治療的新靶點。