姜琳，楊國(guó)輝

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽(yáng)550004)

膿毒癥是感染所致全身炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致嚴(yán)重器官功能障礙。心臟是膿毒癥最易受損器官之一，內(nèi)毒素脂多糖、細(xì)胞因子、氧自由基等通過多種途徑損傷心肌，可致膿毒性心肌病[1]。自噬作為一種細(xì)胞死亡方式已成為目前研究的熱點(diǎn)。在膿毒癥動(dòng)物模型中觀察到自噬體和自噬相關(guān)基因產(chǎn)物增加，自噬通過吞噬并降解病原微生物，與免疫反應(yīng)共同保護(hù)機(jī)體[2]。2016年6月～2017年12月，我們通過觀察膿毒癥大鼠心肌微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)表達(dá)的變化，并給予鈣通道阻滯劑維拉帕米干預(yù)，探討維拉帕米對(duì)膿毒癥的心肌保護(hù)作用，為膿毒性心肌病的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠54只，體質(zhì)量(200±20)g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。鹽酸維拉帕米注射液(上海禾豐公司)，兔源Beclin-1單克隆抗體、兔源LC3多克隆抗體、兔源Bcl-2單克隆抗體(Abcam公司)，兔源β-actin單克隆抗體(博奧森公司)，辣根酶標(biāo)記抗山羊IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，高靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(默克密理博公司)。

1.2 動(dòng)物分組與模型制備 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、干預(yù)組各18只。模型組和干預(yù)組采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)[3]制備膿毒癥模型。術(shù)前禁食12 h，自由飲水。采用2%戊巴比妥鈉10 mL/kg腹腔注射麻醉，腹正中切口；于盲腸盲端1/3處結(jié)扎，使用20 G套管針將盲腸貫通穿孔，輕輕擠出少許糞便；將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口。對(duì)照組麻醉后行下腹正中切口，取出盲腸不結(jié)扎穿孔仍放回腹腔。三組術(shù)后均給予生理鹽水30 mL/kg腹腔注射，干預(yù)組另給予鹽酸維拉帕米注射液5 mg/kg腹腔注射。待大鼠完全蘇醒后送回飼養(yǎng)室正常飼養(yǎng)。

1.3 標(biāo)本采集 三組分別于術(shù)后6、12、24 h各處死6只大鼠。取出心臟，生理鹽水洗凈，去除大血管及結(jié)締組織，取心肌組織用于組織形態(tài)學(xué)檢查和相關(guān)分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.4 血清肌鈣蛋白T(cTnT)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)檢測(cè) 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉10 mL/kg麻醉，暴露心臟，取心臟血5 mL，移至1.5 mL EP管中。離心，取上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)cTnT、CK-MB水平，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 心肌組織形態(tài)學(xué)檢查 取大鼠心臟，用生理鹽水洗凈，去除大血管及結(jié)締組織，取0.5 mm3心肌組織投入預(yù)先配好的固定液中(10%甲醛)，固定成功后放入包埋盒中，流水沖洗(去除組織中的固定液)30 min，梯度乙醇脫水，再將組織塊置于透明劑二甲苯中，以二甲苯替換出組織塊中的乙醇。將已透明的組織塊置于石蠟中包埋，切片機(jī)將蠟塊切成薄片，厚約5 μm，于水中攤平，貼到載玻片上，放入45 ℃恒溫箱中烘干。二甲苯脫蠟，再經(jīng)由高濃度到低濃度乙醇，最后入蒸餾水，蘇木精伊紅染色后置于光鏡下觀察。

1.6 心肌組織LC3、Beclin-1、Bcl-2蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。使用蛋白提取試劑盒提取心肌組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取蛋白上樣液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶室溫封閉2 h，TBST洗膜。分別加入LC3(1∶2 000)、Beclin-1(1∶2 000)、Bcl-2(1∶5 000)及β-actin(1∶2 000)一抗，4 ℃孵育過夜。次日TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)IgG二抗(1∶5 000)，室溫孵育50 min。ECL化學(xué)發(fā)光顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)條帶，Image J軟件測(cè)出目的條帶的灰度值，并與內(nèi)參條帶的灰度值比較，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 心肌組織LC3、Beclin-1、Bcl-2 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用qRT-PCR法。TRIzol法提取大鼠心肌組織總RNA，測(cè)定濃度及純度后按照試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。引物序列：LC3上游引物5′-ATTGCTGTCCCGAATGTCTC-3′，下游引物5′-TTCTTCCTCCTGGTGAATGG-3′；Beclin-1上游引物5′-TATAGCAAAGAGCCCTGCCG-3′，下游引物5′-AACTGTGTGCCACAAGCATC-3′；Bcl-2上游引物5′-ACAGAGGGGCTACGAGTGGG-3′，下游引物5′-CGTTCGGTTGCTCTCAGGC-3′；β-actin上游引物5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游引物5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′。反應(yīng)體系(25 μL)：SYBR?Premix Ex TaqⅡ 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA模2.0 μL，dH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后讀取各樣本的Ct值，應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以x±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清cTnT、CK-MB水平比較 見表1。

表1 三組血清cTnT、CK-MB水平比較

注：與對(duì)照組相同時(shí)間比較，aP<0.05；與模型組相同時(shí)間比較，bP<0.05；與同組6 h比較，cP<0.05；與同組12 h比較，dP<0.05。

2.2 三組心肌組織形態(tài)學(xué)比較 對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，間質(zhì)無明顯增生，心肌細(xì)胞無明顯肥大等表現(xiàn)；模型組心肌細(xì)胞排列紊亂，明顯肥大，胞質(zhì)豐富，可見血管擴(kuò)張和血管壁增厚；干預(yù)組心肌細(xì)胞排列紊亂、肥大程度較模型組減輕。

2.3 各組心肌組織LC3、Beclin-1、Bcl-2蛋白表達(dá)比較 見表2。

表2 各組心肌組織LC3、Beclin-1、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組相同時(shí)間比較，aP<0.05；與模型組相同時(shí)間比較，bP<0.01；與同組6 h比較，cP<0.05；與同組12 h比較，dP<0.05。

2.4 各組心肌組織LC3、Beclin-1、Bcl-2 mRNA表達(dá)比較 見表3。

3 討論

膿毒癥病情進(jìn)展迅速，臨床治療效果差，病死率高。研究表明，約50%的膿毒癥患者可出現(xiàn)心臟功能障礙,伴有心臟功能障礙患者的病死率達(dá)70%，而不伴心臟功能障礙患者的病死率為20%[4]。膿毒癥心肌損傷的機(jī)制包括內(nèi)皮素1升高、線粒體受損、炎癥因子對(duì)心肌的損傷、前列環(huán)素升高、缺血再灌注和氧自由基損傷、細(xì)胞鈣超載等[5]。cTnT、CK-MB是檢測(cè)心肌細(xì)胞受損的可靠指標(biāo)，二者升高提示病情進(jìn)行性加重，可能存在心臟功能障礙和預(yù)后不良[6]。本研究結(jié)果顯示，模型組6、12、24 h時(shí)血清CK-MB、cTnT均較對(duì)照組升高，模型組血清CK-MB、cTnT隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，干預(yù)組血清CK-MB、cTnT均較模型組降低。上述結(jié)果提示膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞損傷，予維拉帕米干預(yù)后可保護(hù)心肌細(xì)胞，減輕心肌損傷。

表3 各組心肌組織LC3、Beclin-1、Bcl-2 mRNA表達(dá)比較

注：與對(duì)照組相同時(shí)間比較，aP<0.05；與模型組相同時(shí)間比較，bP<0.01；與同組6 h比較，cP<0.05；與同組12 h比較，dP<0.05。

自噬是指在應(yīng)激條件下，如饑餓、營(yíng)養(yǎng)缺乏、微生物入侵等，在自噬基因ATG調(diào)控下，可發(fā)生適應(yīng)性細(xì)胞自噬現(xiàn)象，以維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能和代謝的需要，維持細(xì)胞正常的生理功能。自噬包括誘導(dǎo)、自噬體形成、自噬溶酶體形成、降解和降解物質(zhì)的循環(huán)再利用四個(gè)環(huán)節(jié)[7]。自噬體標(biāo)記蛋白LC3貫穿自噬體形成的過程。LC3是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白，參與吞噬泡的形成，貫穿自噬體形成的始終。細(xì)胞內(nèi)存在LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式，自噬過程中，一部分LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變成LC3-Ⅱ，而LC3蛋白在細(xì)胞內(nèi)總的表達(dá)水平無明顯上調(diào)，即自噬表現(xiàn)為L(zhǎng)C3-Ⅰ減少和LC3-Ⅱ增加，通過LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ或LC3-Ⅱ/(LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ)即可反映自噬水平[8]。Beclin-1是與酵母Apg6/Vps30同源基因，可通過結(jié)構(gòu)域結(jié)合于自噬體細(xì)胞膜上，在自噬中的作用主要調(diào)節(jié)自噬體膜的延伸過程，成為檢測(cè)自噬的指標(biāo)之一，研究發(fā)現(xiàn)，抗凋亡蛋白Bcl-2能通過疏水凹槽與Beclin-1結(jié)合，從而抑制Beclin-1及其復(fù)合體誘導(dǎo)自噬的功能[9]。

隨著對(duì)自噬的深入研究，自噬在炎癥、感染等病理生理過程的積極作用逐漸被重視，自噬為膿毒癥相關(guān)的器官功能障礙的防治提供了新的方向。Hsieh等[10]報(bào)道，小鼠盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后8 h即可出現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1升高，隨著病程進(jìn)展，自噬泡數(shù)量增加而自噬溶酶體數(shù)量較少；提示自噬在膿毒癥早期即被激活，隨著膿毒癥小鼠體內(nèi)大量促炎性因子釋放，中和微生物毒素、控制細(xì)胞因子釋放等作用下，從而抑制自噬水平，自噬溶酶體形成障礙，使得膿毒癥過程中自噬沒有發(fā)揮有效保護(hù)作用，從而導(dǎo)致臟器損傷。Tong等[11，12]報(bào)道，大鼠缺血缺氧心肌組織自噬激活后，自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1較對(duì)照組增高，Bcl-2較對(duì)照組降低，誘導(dǎo)自噬過程完整后可對(duì)心肌起到保護(hù)作用。

自噬是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)，并由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子含量和釋放調(diào)節(jié)，膿毒癥時(shí)細(xì)胞鈣通道失衡、鈣超載從而激活自噬。自噬的發(fā)生及調(diào)節(jié)機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，通過對(duì)自噬水平調(diào)控的研究，可使自噬在疾病過程中發(fā)揮積極保護(hù)作用。細(xì)胞內(nèi)鈣離子是調(diào)控自噬的重要因素，維拉帕米為鈣通道阻滯劑，抑制鈣離子內(nèi)流，而鈣離子對(duì)激活自噬具有積極作用[13，14]。鈣離子濃度增加可促進(jìn)自噬相關(guān)基因5增加和自噬過程中細(xì)胞信號(hào)調(diào)控相關(guān)的腺苷酸活化蛋白激酶表達(dá)，從而上調(diào)細(xì)胞自噬水平[15]。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞明顯肥大，排列紊亂，模型組6、12、24 h時(shí)血清CK-MB、cTnT均較對(duì)照組升高，LC3、Beclin-1蛋白及mRNA表達(dá)較對(duì)照組升高，Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)較對(duì)照組降低；模型組血清CK-MB、cTnT隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，LC3、Beclin-1蛋白及mRNA隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，Bcl-2蛋白及mRNA隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降。提示膿毒癥時(shí)心肌細(xì)胞鈣通道失衡、鈣超載及微生物入侵等因素心肌細(xì)胞受損并激活自噬，在24 h內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng)自噬逐漸增強(qiáng)。與模型組比較，干預(yù)組心肌組織排列紊亂、心肌細(xì)胞肥大嚴(yán)重程度較輕，干預(yù)組12、24 h時(shí)LC3較模型組降低，6、12、24 h時(shí)Beclin-1蛋白及mRNA表達(dá)較模型組降低，Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)較模型組升高，血清CK-MB、cTnT均較模型組降低。表明膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)鈣通道失衡，激活自噬，給予維拉帕米拮抗鈣超載后，可抑制自噬，保護(hù)心肌細(xì)胞。

綜上所述，膿毒癥大鼠心肌組織自噬早期可被激活，并在24 h內(nèi)逐漸增強(qiáng)；通過維拉帕米調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣離子從而調(diào)節(jié)自噬水平后，可有效抑制自噬，進(jìn)一步保護(hù)心肌。