譚婉燕，楊旭輝

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，武漢430077)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一類病因不明、癌變風(fēng)險(xiǎn)較高的非可控性炎癥性疾病，具有病程長(zhǎng)、病變程度輕重不一、反復(fù)發(fā)作、治愈難度大等特點(diǎn)[1]。尋找有效的治療靶點(diǎn)對(duì)改善UC的臨床療效具有重要意義。含Src同源區(qū)2蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶2(SHP2)是一種由PTPN11基因編碼的非受體型蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶，作為蛋白酪氨酸磷酸酶家族的一員，其通過(guò)多條信號(hào)傳導(dǎo)通路參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遷移、黏附及凋亡等重要生命活動(dòng)[2]。SHP2廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞和組織中，與腦膠質(zhì)瘤、大腸癌、乳腺癌和宮頸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3]，但SHP2在UC中的作用目前仍不清楚。炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展與炎性因子的過(guò)度表達(dá)有關(guān)，其中環(huán)氧合酶2(COX-2)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)是UC中研究較多的炎性因子。P65和信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)信號(hào)通路與UC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，它們通過(guò)調(diào)控相關(guān)炎性因子的釋放，參與腸道的炎癥反應(yīng)[4，5]。Ki67作為一種在細(xì)胞增殖中不可缺少的核抗原，其表達(dá)水平可反映細(xì)胞增殖速度[6，7]。2017年1～12月，我們通過(guò)建立小鼠UC模型，觀察結(jié)腸組織中SHP2的表達(dá)情況，并通過(guò)構(gòu)建腺病毒SHP2突變載體下調(diào)SHP2表達(dá)，觀察血清炎性因子COX-2、IL-6、TNF-α及結(jié)腸組織中NF-κB/STAT3信號(hào)通路蛋白的變化，探討SHP2在UC發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 SPF級(jí)健康雄性BALB/c小鼠30只，4～6周齡，體質(zhì)量19～21 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要試劑：葡聚糖硫酸鈉(DSS， MW40000，MPBio，美國(guó))，腺病毒稀釋液(Sigma-Aldrich，美國(guó))，小鼠COX-2、IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，中國(guó))，兔源多克隆GAPDH抗體(杭州賢至生物有限公司，中國(guó))，兔源多克隆抗體SHP2(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，中國(guó))，兔源多克隆抗體p-P65(CST，美國(guó))，兔源單克隆抗體p-STAT3(CST，美國(guó))，Ki67抗體(Abcam，美國(guó))，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，中國(guó))。腺病毒突變載體pAd-pG1.2-mus-shp2-2的構(gòu)建委托賽業(yè)生物科技有限公司設(shè)計(jì)。主要儀器：低溫離心機(jī)(Thermo scientific，美國(guó))，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo scientific，美國(guó))，電熱恒溫培養(yǎng)箱(ASONE，日本)，電泳儀(Bio-Rad，美國(guó))，Chemi Doc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))。

1.2 急性UC模型制作 將30只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和SHP2組，每組各10只。模型組和SHP2組給予4% DSS溶液飲用7 d制作急性UC模型[8]，正常組飲用高壓過(guò)的飲用水。當(dāng)小鼠出現(xiàn)不同程度的進(jìn)食及進(jìn)飲減少、體質(zhì)量下降、腹瀉、血便、肛周毛發(fā)凌亂、肛口稀血便黏附時(shí)，表明造模成功。繼續(xù)飼養(yǎng)20 d。

1.3 腺病毒轉(zhuǎn)染 于造模第1天分別向正常組、模型組和SHP2組腹腔注射100 μL腺病毒稀釋液、腺病毒空載體和腺病毒SHP2突變載體。造模第8天取5只小鼠處死，取結(jié)腸組織，采用Western blotting法檢測(cè)SHP2蛋白表達(dá)，以驗(yàn)證腺病毒在小鼠腸道組織的轉(zhuǎn)染效率，以轉(zhuǎn)染效率≥70%為轉(zhuǎn)染合格。

1.4 腸道臨床炎癥嚴(yán)重程度評(píng)估 飼養(yǎng)期間每天測(cè)量小鼠體質(zhì)量，檢查肛周，記錄排便情況。采用疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分量表[8]對(duì)腹瀉、便血、體質(zhì)量改變情況進(jìn)行評(píng)分。

1.5 組織病理學(xué)檢查 飼養(yǎng)至20 d處死剩余15只小鼠，取結(jié)腸組織，制作病理切片，采用HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化，按照組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[1]進(jìn)行評(píng)分。采用阿爾新藍(lán)染色檢測(cè)組織中杯狀細(xì)胞數(shù)量，根據(jù)杯狀細(xì)胞數(shù)量評(píng)價(jià)結(jié)腸黏膜屏障功能。

1.6 血清COX-2、IL-6、TNF-α檢測(cè) 采用ELISA法。小鼠處死后，收集心臟血，離心取上清，采用小鼠PTGS2/COX-2、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒檢測(cè)血清COX-2、IL-6、TNF-α水平，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 結(jié)腸組織中p-P65、p-STAT3表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取少量結(jié)腸組織置于勻漿器中剪碎，加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，應(yīng)用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。配制10%分離膠和5%濃縮膠，電泳轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，結(jié)合兔抗鼠GAPDH(1∶1 000稀釋)、p-P65(1∶1 000稀釋)和p-STAT3(1∶2 000稀釋)抗體，孵育結(jié)束后洗膜。再滴加羊抗兔二抗，室溫?fù)u床孵育1 h。洗滌后將PVDF膜置于ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)儀器中掃膜，用Image Lab軟件處理圖像，Image J軟件計(jì)算各條帶的灰度值，以目標(biāo)條帶與對(duì)應(yīng)內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 結(jié)腸組織中Ki67表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化染色法。取組織切片常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2去離子水孵育10～30 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。山羊血清封閉15～30 min，加入Ki67一抗(1∶100稀釋)，37 ℃孵育2～3 h，次日滴加HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，逐級(jí)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。根據(jù)每個(gè)高倍鏡視野中陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分；根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色為0分，弱染色為1分，中等染色為2分，強(qiáng)染色為3分；兩項(xiàng)評(píng)分相乘得出最終評(píng)分。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行繪圖和統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組DAI評(píng)分比較 見(jiàn)圖1。從第13天開(kāi)始，SHP2組DAI評(píng)分低于模型組(P均<0.01)。

圖1 各組DAI評(píng)分比較

注：與SHP2組比較，*P<0.01。

2.2 三組組織病理學(xué)檢查結(jié)果 正常組結(jié)腸黏膜基本完整，腺體排列整齊、結(jié)構(gòu)層次清晰，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組結(jié)腸黏膜破損嚴(yán)重，腺體減少、排列紊亂，以淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞的大量浸潤(rùn)，淋巴濾泡增生；SHP2組結(jié)腸炎癥相對(duì)較輕，黏膜基本完整，腺體結(jié)構(gòu)清晰，炎細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)較少。模型組和SHP2組的組織病理學(xué)評(píng)分分別為(15.33±1.53)、(10.67±2.08)分，與模型組相比，SHP2組評(píng)分降低(P<0.05)。模型組、SHP2組、正常組結(jié)腸上皮杯狀細(xì)胞數(shù)量分別為(60.67±3.06)、(70.31±4.51)、(85.33±2.52)個(gè)，模型組杯狀細(xì)胞數(shù)量較正常組減少，SHP2組杯狀細(xì)胞數(shù)量較模型組增加(P均<0.05)。

2.3 三組血清COX-2、IL-6、TNF-α水平比較 模型組COX-2、IL-6、TNF-α水平高于正常組，SHP2組COX-2、IL-6、TNF-α水平低于模型組(P均<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 三組血清COX-2、IL-6、TNF-α水平比較(x±s)

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01。

2.4 三組結(jié)腸組織p-P65、p-STAT3、Ki67表達(dá)水平比較 模型組結(jié)腸組織中p-P65、p-STAT3、Ki67蛋白表達(dá)水平較正常組升高，SHP2組上述指標(biāo)表達(dá)水平較模型組降低(P均<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 三組結(jié)腸組織p-P65、p-STAT3、Ki67表達(dá)水平比較

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01。

3 討論

UC是一種以腸道慢性非特異性炎癥為特征的腸道疾病，其臨床表現(xiàn)主要為血性腹瀉、腹痛、便血以及體質(zhì)量減輕等。DAI評(píng)分作為一種以大便性狀改變程度、便血程度以及體質(zhì)量下降程度為指標(biāo)的評(píng)價(jià)方式，已被廣泛用于評(píng)估UC的活動(dòng)程度[8]。為了探討SHP2在UC中的作用，我們利用4% DSS溶液制作急性UC模型，并通過(guò)構(gòu)建腺病毒SHP2突變載體，使SHP2在小鼠腸道組織低表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SHP2組小鼠DAI評(píng)分降低，提示下調(diào)SHP2表達(dá)可改善急性UC模型小鼠的疾病活動(dòng)程度。

腸道的組織病理學(xué)檢查及評(píng)分可從組織結(jié)構(gòu)上進(jìn)一步鑒別UC的嚴(yán)重程度。在UC中，常通過(guò)HE染色觀察腸道黏膜的破壞程度、腺體的排列及結(jié)構(gòu)層次以及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)等來(lái)進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。本研究結(jié)果顯示，SHP2組腸道炎癥程度及組織病理學(xué)評(píng)分顯著高于對(duì)照組，但低于模型組，表明下調(diào)SHP2的表達(dá)可緩解UC小鼠的疾病情況，這與上述DAI評(píng)分相一致。此外，結(jié)腸黏膜上皮中杯狀細(xì)胞的數(shù)量也可在一定程度上反映小鼠UC的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果顯示，SHP2組小鼠結(jié)腸上皮中杯狀細(xì)胞的數(shù)目介于正常組和模型組之間。上述研究結(jié)果表明，SHP2可能是UC發(fā)生發(fā)展的一個(gè)促進(jìn)因素，抑制其表達(dá)對(duì)UC具有一定的治療作用。

STAT3作為一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，可被細(xì)胞因子激活發(fā)生磷酸化成為p-STAT3，從而發(fā)揮生物學(xué)功能。研究表明，STAT3信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控TNF-α、IL-6、COX-2等炎性因子的釋放而參與組織炎癥反應(yīng)[4]。STAT3在UC發(fā)病機(jī)制中的重要作用已得到證實(shí)，STAT3蛋白及mRNA表達(dá)水平與疾病的活動(dòng)度呈正比[9]。P65是NF-κB中促炎作用最為顯著的亞單位，其作為炎癥性腸病中炎癥級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)及瀑布樣效應(yīng)的開(kāi)關(guān)，在UC發(fā)病過(guò)程中起著核心作用[10]。本研究結(jié)果顯示，p-P65和p-STAT3在模型組結(jié)腸組織中的表達(dá)較正常組升高，而在SHP2組的表達(dá)較模型組降低；提示SHP2可能通過(guò)激活NF-κB/STAT3相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與UC的發(fā)生發(fā)展。

既往研究表明，P65的活化結(jié)構(gòu)即p-P65可通過(guò)介導(dǎo)促炎因子如TNF-α、IL-2、IL-6等的產(chǎn)生而參與UC的病理生理過(guò)程[11]。同時(shí)，SHP2已被證實(shí)參與RAS-RAF-MAPK、JAK-STAT、NF-κB、ERK、P13K等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)[12]。本研究結(jié)果顯示，模型組血清COX-2、IL-6、TNF-α水平較正常組升高，而SHP2組上述指標(biāo)較模型組降低。提示SHP2可能通過(guò)激活NF-κB/STAT3相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而促進(jìn)炎性因子COX-2、IL-6、TNF-α的產(chǎn)生和釋放，從而介導(dǎo)UC的發(fā)生發(fā)展。

Ki67作為一類與細(xì)胞周期相關(guān)的增殖細(xì)胞核抗原，是目前應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞增殖標(biāo)志物之一，其表達(dá)水平高低可用于評(píng)估細(xì)胞的增殖程度[6，7]。本研究結(jié)果顯示，模型組結(jié)腸組織中Ki67表達(dá)水平高于正常組，而SHP2組Ki67表達(dá)水平較模型組降低。提示SHP2可能通過(guò)促進(jìn)Ki67的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞的增殖，從而參與UC的發(fā)病過(guò)程。

綜上所述，SHP2在小鼠UC的起病中發(fā)揮促進(jìn)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB/STAT3信號(hào)通路的激活，促進(jìn)炎性因子COX-2、IL-6、TNF-α產(chǎn)生和釋放，從而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞的增殖，介導(dǎo)炎癥的發(fā)生；抑制SHP2表達(dá)可改善小鼠腸道UC的炎癥情況。因此，SHP2具有作為UC臨床治療靶點(diǎn)的巨大潛力，值得進(jìn)一步深入研究。