王雨，李萍

(1江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，武漢430056；2遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院)

涎腺腺樣囊性癌(SACC)是常見(jiàn)的涎腺惡性腫瘤，以嗜神經(jīng)性強(qiáng)、易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為特點(diǎn)，長(zhǎng)期生存率低。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和生長(zhǎng)素(Survivin)在SACC組織中表達(dá)異常，其與SACC的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[1，2]。目前臨床治療SACC主要采取手術(shù)結(jié)合放化療，但由于其較強(qiáng)的浸潤(rùn)性，無(wú)法完全根除，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，且放化療不良反應(yīng)嚴(yán)重，價(jià)格也比較昂貴，因此研究出一種新的廉價(jià)、高效、低毒的治療藥物意義重大。淫羊藿為小檗科草本植物，具有強(qiáng)筋骨、壯陽(yáng)、祛風(fēng)濕等功效。淫羊藿苷(ICA)是淫羊藿的主要單體成分，具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、改善心血管功能、抗氧化、增加免疫活性及抗腫瘤等作用，其在抗腫瘤方面的表現(xiàn)備受關(guān)注[3]。2016～2017年，我們觀察了ICA對(duì)SACC細(xì)胞增殖和凋亡的影響，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中PCNA、Survivin表達(dá)的變化，探討ICA治療SACC的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 SACC-M細(xì)胞系來(lái)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ICA來(lái)自遵義醫(yī)學(xué)院藥理教研室。單克隆抗體PNCA、Survivin(上?；蚩萍脊?，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(Thermo Fisher公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(BIO-RAD，美國(guó))，全自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀(Thermo，美國(guó))，蛋白電泳系統(tǒng)(BIO-RAD，美國(guó))，TMS-1015型倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)，流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 向細(xì)胞中加入含10%胎牛血清和青-鏈霉素的改良型RPMI1640培養(yǎng)基、5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分為對(duì)照組和ICA低、中、高濃度組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.3 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)算 采用MTT實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL。按100 μL/孔加入96孔板中，培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，ICA低、中、高濃度組分別加入終濃度100、200、400 μg/mL的ICA，對(duì)照組加入細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)不加細(xì)胞的培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。分別于培養(yǎng)24、48、72 h后，取出96孔板，每孔再放入20 μL MTT，培養(yǎng)4 h。去除孔內(nèi)的培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL，震動(dòng)15 min左右，使結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定各孔光密度OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白對(duì)照孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-空白對(duì)照孔OD值)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按2×105/孔接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。ICA低、中、高濃度組分別加入終濃度100、200、400 μg/mL的ICA，對(duì)照組加入細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，常規(guī)消化細(xì)胞，冷PBS沖洗，2 000 r/min離心5 min。加入500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析各組細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=AnnexinⅤ陽(yáng)性的早晚期凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 細(xì)胞中PCNA、Survivin蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。提取細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒定量蛋白濃度。加入20 μL樣品到每道中進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白分離出來(lái)后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別加入β-actin、PCNA、Survivin一抗，4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜，再分別與相應(yīng)的二抗結(jié)合，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜3×10 min。采用Image J軟件分析目的條帶與β-actin的灰度值，以目的條帶與β-actin灰度值的比值計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞中PCNA、Survivin mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCNA上游引物5′-GGCGCTAGTATTTGAAGCACCA-3′,下游引物5′-GGCATATACGTGCAAATTCACCA-3′；Survivin上游引物5′-CACAGCAGTGTTTGAAATGACAGG-3′，下游引物5′-AGTCTGGCGTAAGATGATGGATTTG-3′；β-action上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min預(yù)變性；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；55 ℃ 10 s，81個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以x±s表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)多組間比較使用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 ICA高濃度組細(xì)胞增殖抑制率較中、低濃度組升高，中濃度組較低濃度組升高(P均<0.05)；ICA低、中、高濃度組細(xì)胞增殖抑制率72 h高于48 h和24 h，48 h高于24 h(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較(%，x±s)

注：與ICA低濃度組比較，aP<0.05；與ICA中濃度組比較，bP<0.05；與同組24 h比較，cP<0.05；與同組48 h比較，dP<0.05。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為1.08%±0.19%，ICA低、中、高濃度組細(xì)胞凋亡率分別為8.25%±1.32%、18.26%±1.51%、36.08%±7.01%。ICA組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組升高，高濃度組較中、低濃度組升高，中濃度組較低濃度組升高(P均<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞PCNA、Survivin蛋白表達(dá)比較 ICA中、高濃度組細(xì)胞PCNA、Survivin蛋白表達(dá)低于對(duì)照組(P均<0.05)，ICA低濃度組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞PCNA、Survivin蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.4 各組細(xì)胞PCNA、Survivin mRNA表達(dá)比較 ICA低、中、高濃度組PCNA、Survivin mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞PCNA、Survivin mRNA表達(dá)比較(x±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

由于SACC對(duì)放化療均不敏感，因此目前臨床上仍以手術(shù)治療為主，強(qiáng)調(diào)在盡量少影響功能的基礎(chǔ)上對(duì)腫瘤進(jìn)行徹底切除，并在術(shù)后給予局部適量的放療以提高療效，而化療則常作為處理其復(fù)發(fā)癥狀的措施。然而放療和化療都具有一定的不良反應(yīng)，放療可導(dǎo)致患者乏力、過(guò)敏、脫發(fā)、造血功能下降等，化療可以導(dǎo)致局部組織壞死、靜脈炎、骨髓抑制、胃腸毒性、免疫抑制、腎毒性等。有研究證實(shí)，ICA可以減少放化療的不良反應(yīng)。葛林阜等[4]在小鼠接受60Co照射后給予ICA，檢測(cè)外周血白細(xì)胞總數(shù)及分類、骨髓和脾臟粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞克隆形成單位(CFU-GM)計(jì)數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)ICA可促進(jìn)小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)增加，增加骨髓和脾臟粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞CFU-GM集落形成，說(shuō)明ICA具有明顯的促進(jìn)血液功能恢復(fù)的作用。趙連梅等[5]通過(guò)腹腔注射環(huán)磷酰胺建立C57BL/6j小鼠免疫抑制模型，檢測(cè)灌服ICA的免疫抑制小鼠脾臟和胸腺指數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)等各項(xiàng)免疫指標(biāo)，結(jié)果顯示，ICA提高了免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，促進(jìn)了免疫抑制小鼠免疫細(xì)胞的增殖和成熟，提示ICA能促進(jìn)小鼠免疫功能，具有逆轉(zhuǎn)化療后小鼠免疫抑制狀態(tài)的作用。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)多因素參與的生理過(guò)程，涉及到免疫應(yīng)答、基因調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)等多種過(guò)程[6]。細(xì)胞凋亡在多種正常生理過(guò)程中可起到調(diào)節(jié)作用，若此功能出現(xiàn)異?；蛉笔t可導(dǎo)致一系列病理情況發(fā)生。腫瘤細(xì)胞的特征之一就是缺乏這種程序性的死亡過(guò)程，而抗腫瘤中藥可以誘導(dǎo)這種程序性死亡，從而達(dá)到治療腫瘤的目的[7]。本研究結(jié)果顯示，采用不同濃度的ICA處理SAAC-M細(xì)胞24、48、72 h后，高濃度組細(xì)胞增殖抑制率較中、低濃度組升高，中濃度組較低濃度組升高；ICA低、中、高濃度組細(xì)胞增殖抑制率72 h高于48 h和24 h，48 h高于24 h。ICA不同濃度組細(xì)胞凋亡率均較對(duì)照組升高，高濃度組較中、低濃度組升高，中濃度組較低濃度組升高。說(shuō)明ICA具有抑制SACC-M細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的作用。

SACC的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移是由多種基因及其表達(dá)產(chǎn)物共同參與的過(guò)程，其中相關(guān)基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、血管生成等生理活動(dòng)中起重要作用。PCNA為DNA聚合酶δ的輔助蛋白，參與細(xì)胞增殖過(guò)程中DNA的復(fù)制，反映細(xì)胞增殖活性，可作為判斷細(xì)胞增殖狀態(tài)的一項(xiàng)指標(biāo)。PCNA可調(diào)節(jié)G1期細(xì)胞進(jìn)入S期，參與DNA復(fù)制過(guò)程所需的聚合酶的合成，其水平高低與細(xì)胞增殖速度密切相關(guān)[8，9]。研究證實(shí)，PCNA參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10，11]。李偉等[12]認(rèn)為，胃癌組織分化愈差，PCNA強(qiáng)表達(dá)率愈高，增殖活性愈高。本研究結(jié)果顯示，ICA中、高濃度組細(xì)胞中PCNA mRNA及蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，表明ICA抑制SACC-M細(xì)胞增殖的作用可能與下調(diào)PCNA的表達(dá)有關(guān)。

Survivin位于人染色體17q25上，是目前所知最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白。除胚胎組織外，幾乎所有正常組織中均未檢測(cè)到Survivin，但Survivin在胃癌、肺癌、甲狀腺癌組織中高表達(dá)[13～15]，且與腫瘤細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，ICA不同濃度組細(xì)胞中Survivin mRNA及蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組，表明ICA促進(jìn)SACC-M細(xì)胞的凋亡可能與下調(diào)Survivin的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi)，ICA能夠阻止SACC-M細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與PCNA、Survivin表達(dá)下降有關(guān)。