康曉亮，朱世高，陳述海，孫兆偉，朱呈瞻，馮玉杰，褚國慶，楊堃，張炳遠(yuǎn)

(1青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島266003；2濰坊市中醫(yī)院)

膽管癌具有高轉(zhuǎn)移率、高病死率的特點(diǎn)，是最致命的惡性腫瘤之一。目前對膽管癌最有效的治療方法是根治性手術(shù)切除，然而大多數(shù)患者確診時(shí)已是晚期，失去了手術(shù)機(jī)會，化療及放療效果也不佳，預(yù)后很差。因此迫切需要尋找新的、有效的細(xì)胞毒藥物來治療。中醫(yī)藥用于治療腫瘤已取得一定成效。大量研究證實(shí)，中醫(yī)藥具有清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)、理氣健脾、攻毒消積、益氣養(yǎng)陰等多重功效，不僅能有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，而且對正常組織和細(xì)胞的不良反應(yīng)小[1]，可作為腫瘤綜合性治療措施之一。我們的前期研究顯示，中藥復(fù)方抑瘤飲能夠在體外抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，并促進(jìn)其凋亡，在動物模型中也驗(yàn)證了該藥抑制肝腫瘤生長的功效[2]。2017年8月～2018年3月，我們觀察了抑瘤飲對膽管癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討其對膽管癌的治療作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 人膽管癌QBC939細(xì)胞來自青島大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。抑瘤飲組方：黃芪2 g，靈芝1 g，苦杏仁1 g，白花蛇舌草3 g，附子2 g，光果甘草2 g，西洋參1 g，桔梗1 g；均購自福建百草堂藥業(yè)有限公司，由濰坊市中醫(yī)院制成120 mg/mL藥液，-20 ℃儲存。RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素、0.25%胰酶消化液(美國Hyclone公司)，胎牛血清(以色列BI公司)；Hoechst 33258(北京索萊寶生物科技有限公司)，CCK-8凋亡檢測試劑盒(廣州奕源生物科技有限公司)，流式凋亡檢測試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白PARP抗體、Caspase-9抗體、Caspase-12抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體及GAPDH抗體(美國CST公司)。FACSCAI IBUR流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，SAFIRE II-BASIC酶標(biāo)儀(澳大利亞Tecan公司)；FUSION FX7活體成像分析儀(法國Vilber Lourmat公司)；IX73P2F倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及干預(yù) 將細(xì)胞加入含RPMI-1640、10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱。待細(xì)胞長滿后，加入0.25%胰酶消化，以1∶2的比例傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞，隨機(jī)分為抑瘤飲低、中、高濃度組和對照組，抑瘤飲低、中、高濃度組分別加入6、8、12 mg/mL抑瘤飲，對照組加入PBS，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 采用Hoechst 33258熒光染色。從24孔板中取出細(xì)胞爬片，PBS沖洗，甲醇固定。Hoechst 33258避光染色30 min，PBS沖洗、超純水沖洗，抗淬滅劑封片。避光條件下，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4 細(xì)胞增殖抑制率測算 采用CCK-8法。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，向96孔板各孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的吸光度OD值。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞OD值/對照組細(xì)胞OD值)×100%。用同樣的方法檢測培養(yǎng)48 h后細(xì)胞的吸光度OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.5 細(xì)胞凋亡觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，消化、離心，用PBS沖洗2遍。每組細(xì)胞加入1×Binging buffer結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞至1×106/mL，分別取100 μL重懸液(1×105/mL)加入1.5 mL EP管中，再分別加入PI染液，室溫避光孵育15 min，加入400 μL PBS，上流式細(xì)胞儀檢測。數(shù)據(jù)采用FlowJo7.6.1軟件進(jìn)行處理，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.6 細(xì)胞內(nèi)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，消化、離心，加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。制作10%的SDS-聚丙烯凝膠，蛋白樣品按20 μL的體系上樣，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入兔抗PARP多克隆抗體、鼠抗Caspase-9單克隆抗體、兔抗Caspase-12多克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗Bax多克隆抗體和兔抗GAPDH單克隆抗體，孵育過夜。采用Vilber Fusion FX7成像系統(tǒng)顯影采集圖像，Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài) 對照組細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則完整，核膜光滑，細(xì)胞核較大，熒光分布均勻；而抑瘤飲高濃度組細(xì)胞呈明顯的形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞核染色質(zhì)固縮，核內(nèi)熒光分布不均勻，出現(xiàn)畸形核。

2.2 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 抑瘤飲各濃度組細(xì)胞增殖抑制率均高于對照組，其中抑瘤飲高濃度組細(xì)胞增殖抑制率高于低、中濃度組，各組48 h時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率高于24 h(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與同組24 h比較，*P<0.05；與抑瘤飲低濃度組同時(shí)點(diǎn)比較，#P<0.01；與抑瘤飲中濃度組同時(shí)點(diǎn)比較，△P<0.01。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 抑瘤飲低、中、高濃度組和對照組的細(xì)胞凋亡率分別為5.05%±0.79%、9.20%±1.12%、17.10%±1.91%、3.32%±0.73%。與對照組比較，抑瘤飲各濃度組細(xì)胞凋亡率均升高(P均<0.05)。

2.4 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 抑瘤飲各濃度組PARP、Caspase-9、Caspase-12、Bax蛋白表達(dá)均高于對照組，Bcl-2蛋白表達(dá)均低于對照組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

注：與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01。

3 討論

膽管癌是一種原發(fā)于不同部位膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，具有局部侵襲性和高轉(zhuǎn)移率，預(yù)后差。目前對膽管癌治療最有效的方法是根治性手術(shù)切除，然而膽管癌早期進(jìn)展在很大程度上是無癥狀的，大多數(shù)患者確診時(shí)已是晚期，無法行根治性手術(shù)，預(yù)后很差，總體5年生存率小于5%[3]。即使進(jìn)行了完全性手術(shù)切除的患者，仍有50%以上最終發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。由于膽管癌對放療、化療均不敏感，目前還缺乏系統(tǒng)性治療手段，其確診后的平均生存時(shí)間僅為12個月[5]，因此迫切需要尋找新的、有效的藥物來治療膽管癌患者。大量研究表明，腫瘤的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的平衡失調(diào)有關(guān)，因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為治療的新方向。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，膽管癌屬消化系統(tǒng)惡性腫瘤范疇，其惡性程度高、預(yù)后差，平均生存期短；應(yīng)該采取祛邪而不傷正、扶正而不留邪的治療原則，采用健脾益氣、補(bǔ)氣養(yǎng)血之法固其本，同時(shí)予以清利濕熱、退黃、解毒散結(jié)、抑瘤治其標(biāo)，固本祛邪，整體抑瘤，既能有效地抑殺腫瘤細(xì)胞，改善人體失調(diào)的內(nèi)環(huán)境，加強(qiáng)機(jī)體對癌細(xì)胞的監(jiān)控能力，同時(shí)誘導(dǎo)癌細(xì)胞自我凋亡或誘導(dǎo)其分化，使癌細(xì)胞在無不良反應(yīng)的情況下逐步萎縮，從而能對膽管癌患者產(chǎn)生較好的治療效果，達(dá)到減輕癥狀、延長生命的目的。

抑瘤飲是由黃芪、靈芝、苦杏仁、白花蛇舌草、附子、光果甘草、西洋參、桔梗8味中藥組成的復(fù)方制劑。本研究結(jié)果顯示，抑瘤飲能有效抑制膽管癌QBC939細(xì)胞的增殖；在相同時(shí)間段，隨著抑瘤飲濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高；而在相同濃度的抑瘤飲時(shí)，隨著作用時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖抑制率也隨之升高；說明抑瘤飲對膽管癌細(xì)胞的抑制作用具有時(shí)間和濃度依賴性。Hoechst 33258染料是一種無毒的DNA染料，可作為熒光探針與DNA結(jié)合，其能夠穿透細(xì)胞膜，對活細(xì)胞的染色呈漸進(jìn)性，熒光顯微鏡下呈均勻的藍(lán)色熒光。而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，染色體固縮，DNA發(fā)生裂解，胞核內(nèi)的DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使得染料更容易與DNA結(jié)合，因此會出現(xiàn)染色增強(qiáng)的現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，抑瘤飲高濃度組細(xì)胞呈明顯的形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞核染色質(zhì)固縮，核內(nèi)熒光分布不均勻，出現(xiàn)畸形核。

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡[6]，是一種有核細(xì)胞調(diào)控的生理過程，主要通過內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活發(fā)生的自動死亡過程，被認(rèn)為是精細(xì)控制的程序性細(xì)胞死亡途徑。其特點(diǎn)為細(xì)胞萎縮、膜起泡和DNA碎片等，造成DNA含量降低，通過流式細(xì)胞儀檢測時(shí)，就會形成亞二倍體峰，根據(jù)此峰能計(jì)算出細(xì)胞凋亡率。本研究結(jié)果顯示，抑瘤飲各濃度組細(xì)胞凋亡率升高，并隨著藥物濃度的增加，凋亡率也隨之升高。大量研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡的過程中包含著多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。依賴于Caspase的凋亡途徑包括外源信號途徑和內(nèi)源信號途徑，后者主要以線粒體的損傷，從而激活下游的凋亡分子蛋白。為了進(jìn)一步探索抑瘤飲誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞的凋亡機(jī)制，我們檢測了抑瘤飲對依賴于Caspase凋亡途徑的相關(guān)蛋白PARP、Caspase-9、Caspase-12、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平的影響。早期研究表明，線粒體膜的破壞和線粒體膜電位降低是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡性細(xì)胞死亡的生物標(biāo)記[7]。Bcl-2家族和半胱氨酸蛋白酶中的一些促凋亡和抑凋亡蛋白被認(rèn)為是凋亡途徑的執(zhí)行者[8，9]。其中，Bcl-2和Bax是兩類典型的抑凋亡和促凋亡蛋白，細(xì)胞的凋亡取決于促凋亡成員和抑凋亡成員的相對濃度。Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax直接決定了線粒體外膜的各種通道的通透性，從而決定了細(xì)胞的生存與否[10]。再者，Caspase-12和鈣蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶家族中的兩個成員，其在調(diào)節(jié)病理性細(xì)胞死亡中發(fā)揮著重要作用；鈣蛋白酶是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的半胱氨酸內(nèi)肽酶，其可能負(fù)責(zé)切割前體Caspase-12，從而激活Caspase-12；Caspase-12缺陷型細(xì)胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)因子具有抗性，表明Caspase-12可能參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[11～14]。Caspase-12從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)易位至細(xì)胞質(zhì)中，然后直接切割前體Caspase-9，在線粒體膜電位減少的共同作用下，Caspase-9反過來激活Caspase-3[15]，最終激活PARP因子，并隨后響應(yīng)抑瘤飲在膽管癌細(xì)胞中PARP蛋白表達(dá)的增高，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，抑瘤飲各濃度組顯著上調(diào)促凋亡PARP、Caspase-9、Caspase-12、Bax蛋白，而下調(diào)抑凋亡Bcl-2蛋白。推測依賴于Caspase的內(nèi)源信號凋亡途徑可能是抑瘤飲介導(dǎo)膽管癌QBC939細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

綜上所述，中藥復(fù)方抑瘤飲能夠有效抑制體外膽管癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，其凋亡通路可能是依賴于Caspase的內(nèi)源信號凋亡途徑。其對膽管癌的其他作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

(收稿日期：2018-06-27)