蘇 敏， 柏友萍△， 宋威巍， 王 明， 沈瑞睿， 杜康健， 夏行權(quán)， 聶劉旺

(1. 安徽師范大學(xué)體育學(xué)院， 2. 安徽省生物資源保護(hù)和利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 安徽師范大學(xué)， 蕪湖 241003)

我國(guó)人口基數(shù)大，隨著國(guó)人預(yù)期壽命的不斷增加，老年人口增長(zhǎng)迅速。老年人隨著年齡的增長(zhǎng)，新陳代謝能力逐漸降低，使得在相同能量攝入條件下老年肥胖的患病率逐年上升，導(dǎo)致肥胖相關(guān)疾病的發(fā)病率日益增加，嚴(yán)重危害老年人的健康。因此，老年肥胖是我國(guó)一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。探討老年肥胖發(fā)病機(jī)制，預(yù)防和減輕老年肥胖，提高老年人群的生活質(zhì)量成為目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。脂肪細(xì)胞因子是由脂肪組織分泌的，直接或間接參與肥胖和肥胖相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展[1]。脂聯(lián)素(adiponectin)是脂肪細(xì)胞特異分泌的蛋白質(zhì)類激素，是目前發(fā)現(xiàn)的對(duì)人體有保護(hù)作用的脂肪細(xì)胞因子。脂聯(lián)素不僅具有降低胰島素抵抗(insulin resistance，IR)、抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化等生物學(xué)作用，還與肥胖相關(guān)疾病有著密切的關(guān)系。

以往的研究已經(jīng)證實(shí)，運(yùn)動(dòng)是減肥的主要手段，但在減肥過(guò)程中運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖相關(guān)疾病，尤其是對(duì)肥胖導(dǎo)致的胰島素抵抗的干預(yù)機(jī)制目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制定運(yùn)動(dòng)方案，探討運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖老年大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素基因mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)、血漿脂聯(lián)素濃度、胰島素抵抗及血糖的影響，為制定運(yùn)動(dòng)減肥、科學(xué)健身措施，以及預(yù)防老年人肥胖相關(guān)疾病的生理機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

脂聯(lián)素mRNA：引物合成(上海生工技術(shù)有限公司)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(M1705), GoTaq?qPCR Master Mix (A6002) 為Promega產(chǎn)品；Trizol (SN114)，Oligo dT15，Random prime，RNase Inhibitor (R0004)，100 bp DNA Ladder(SN124)，脂聯(lián)素蛋白質(zhì)表達(dá)測(cè)定用電泳緩沖液(25 mmol/L Tris，0.25 mol/L 甘氨酸，0.1% SDS)(SN343)，顯影液、定影液(SN340)，羊抗兔IgG-HRP(H+L) (SN134)，羊抗小鼠IgG-HRP(H+L) (SN135) 為Sunshinebio產(chǎn)品；PVDF膜(Millipore)；Supersignal West Pico Trial kit(Pierce/34079)；兔抗大鼠脂聯(lián)素抗體(Bioss/bs-0471R)；小鼠抗β-actin抗體(Boster/ BM0627)，PageRuler Prestained Protein Ladder (Fermentas/SM0671)。脂聯(lián)素濃度和胰島素濃度測(cè)定用ELISA試劑盒 (美國(guó)TSZ公司，上海研域生科公司代理)；血糖試劑盒(北京利德曼生化股份有限公司)。電子秤(JM-A20001/中國(guó))，臺(tái)式高速離心機(jī)(eppendorf/Centrifuge 5417)，高速冷凍離心機(jī)(力康生物醫(yī)療科技/Neofuge15R)，PCR儀(MJ research/PTC200)，熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(博日/line-gene K FQD-48A)，凝膠成像系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)科技/JD801)，可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)(日立/U-2001)，洗板機(jī)(Tecan Columbus Washer/瑞士)，酶標(biāo)儀(Tecan Sunrise/瑞士)，6跑道大鼠跑臺(tái)(Wi32812/北京)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為老年肥胖大鼠。選取雄性SD大鼠(n=50)，清潔級(jí)，鼠齡21 d。大鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d，測(cè)量其體重為(74.5±7.4) g，體長(zhǎng)為(12.4±0.5) cm。根據(jù)體重?zé)o差異(P>0.05)原則，隨機(jī)分為對(duì)照組(n=12)、實(shí)驗(yàn)組(n=32)與老年運(yùn)動(dòng)組(n=6)，構(gòu)建老年肥胖大鼠模型。對(duì)照組和老年運(yùn)動(dòng)組大鼠喂飼普通飼料(6.0%脂肪率)；實(shí)驗(yàn)組根據(jù)青春期、壯年期和老年期分三個(gè)階段喂飼高脂飼料，第一階段(第4～10周)喂飼36.3%脂肪率飼料，第二階段(第31～32周)和第三階段(第56～60周)喂飼40.0%脂肪率飼料。老年肥胖大鼠建模成功的依據(jù)為：鼠齡60周，體重≥對(duì)照組體重120%[2]。60周后，非肥胖大鼠(對(duì)照組和老年運(yùn)動(dòng)組)體重為(758.7±45.6) g，根據(jù)肥胖標(biāo)準(zhǔn)，肥胖大鼠建模成功的體重≥910.5 g。實(shí)驗(yàn)期間，大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)房的相對(duì)濕度為50%～70%，溫度20℃±2℃，每天光照12 h，每周測(cè)量一次體重。本次實(shí)驗(yàn)用SD大鼠、大鼠飼料和墊料均購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，該項(xiàng)研究獲得安徽師范大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)會(huì)的同意(20130225)，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處死采用麻醉方法，符合中華人民共和國(guó)頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[3]。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

考慮到本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組與老年運(yùn)動(dòng)組飼養(yǎng)方式相同，將其合并隨機(jī)選取12只大鼠，再隨機(jī)分為對(duì)照組(control group，C)和老年運(yùn)動(dòng)組(aged exercise group，AE)，n=6，體重分別為(766.4±39.3) g和(768.0±17.7) g。選擇老年肥胖大鼠12只，隨機(jī)分為2組(n=6)，肥胖對(duì)照組(obese control group，OC)和肥胖運(yùn)動(dòng)組(obese exercise group，OE)，體重分別為(952.6±69.7) g和(940.5±68.4) g，組間體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。運(yùn)動(dòng)干預(yù)期間，各組大鼠每天每只定量供給30 g喂普通飼料。實(shí)驗(yàn)期間，大鼠死亡2只(C組與OC組各1只)。

1.4 運(yùn)動(dòng)方案

運(yùn)動(dòng)組大鼠第61周開始進(jìn)行為期5 d，每天2～3次的適應(yīng)性跑臺(tái)練習(xí)。該運(yùn)動(dòng)方案設(shè)計(jì)以本實(shí)驗(yàn)室前期研究中的大鼠運(yùn)動(dòng)方案為依據(jù)[4]。該運(yùn)動(dòng)處方方案為大鼠跑臺(tái)坡度為0°。運(yùn)動(dòng)處方：15 m/min×15 min為1組，共運(yùn)動(dòng)4組，組間休息5 min，1次/天，5次/周，每周二和周五休息，共持續(xù)8周。對(duì)照組不運(yùn)動(dòng)，安靜狀態(tài)下籠養(yǎng)。

1.5 采樣與測(cè)試

經(jīng)8周運(yùn)動(dòng)方案干預(yù)后，大鼠停止運(yùn)動(dòng)2 d。隨后禁食12 h，禁水6 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，剖腹取大鼠腹主動(dòng)脈血液，立即抗凝分離血漿，部分血漿用于測(cè)定空腹血糖，部分血漿保存于-80 ℃冰箱待測(cè)定胰島素和脂聯(lián)素濃度。計(jì)算胰島素抵抗[IR=(G0×I0)/22.5，I0為空腹血漿胰島素含量(mU/L)，G0為空腹血糖濃度(mmol/L)[5]]。采集大鼠內(nèi)臟脂肪組織，取部分含血管少的脂肪立即置于Trizol中，待脂聯(lián)素mRNA表達(dá)測(cè)定；部分內(nèi)臟脂肪組織用鋁箔紙包裹，待脂聯(lián)素蛋白質(zhì)表達(dá)測(cè)定。樣本均保存于-80℃冰箱。

1.5.1 qRT- PCR測(cè)定各組大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá) 脂聯(lián)素引物：上游GGGACAACAATGGACTCTATG，下游CTGTCGCCTGTTCTTT-GATTC；β-actin上游CTAGAGGGTGTCCGCAATG，下游CAGTGGGAAGGTGTAGTC-AGTC。

內(nèi)臟脂肪組織中總RNA：勻漿→相分離→RNA沉淀→RNA洗滌→RNA溶解。RT反應(yīng)以脂聯(lián)素mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，SYBR Green Realtime-PCR，PCR擴(kuò)增：95℃ 2 min預(yù)變性，1個(gè)循環(huán)；95℃ 10 s變性，60℃ 1 min退火及延伸，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析：溫度控制在60 ℃～95 ℃，溫度間隔0.3 ℃，時(shí)間5 s/次，脂聯(lián)素Tm值為79.5 ℃。閾值與Ct值由軟件自動(dòng)得出，ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(β-actin)，采用2-ΔCt法計(jì)算相對(duì)定量。

1.5.2 Western blot測(cè)定各組內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素蛋白表達(dá) 取20 μl稀釋好的上樣樣品至0.5 ml離心管中，加入4 μl 6×SDS上樣緩沖液。配制5%的聚丙烯酰胺濃縮膠電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將切好的膜置于甲醇中活化15 s后，移至轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡，然后將凝膠上的脂聯(lián)素蛋白質(zhì)移至PVDF膜上，以250 mA電流轉(zhuǎn)移1.5 h。將含有脂聯(lián)素的膜用TBS移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h。加封閉液將內(nèi)參一抗(1∶1 000稀釋)，兔抗(1∶500稀釋)、4℃孵育過(guò)夜，用TBST室溫下脫色搖床上清洗4次。同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液(1∶2 000)并與膜接觸，室溫下孵育1 h后，室溫下脫色搖床上用TBST清洗5次。將化學(xué)發(fā)光試劑與膜中的蛋白質(zhì)混合孵育，最后將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)和Image J2軟件分析目的條帶的凈吸光度值。

1.5.3 ELISA測(cè)定各組血漿脂聯(lián)素濃度 采用ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)的雙抗體夾心法測(cè)定樣本中脂聯(lián)素及胰島素濃度。在Excel表格中，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，縱坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)的吸光度 (absorbance，A)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線。脂聯(lián)素標(biāo)準(zhǔn)品試劑測(cè)量值與實(shí)際測(cè)量值相關(guān)系數(shù)r=0.997，曲線方程為y=0.009x-0.018；胰島素標(biāo)準(zhǔn)品試劑測(cè)量值與實(shí)際測(cè)量值相關(guān)系數(shù)r=0.999，曲線方程為y=0.020x+0.008，把該方程代入Excel表中，得到相應(yīng)的濃度值，再乘以5則為樣本實(shí)際濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)后老年肥胖大鼠脂肪組織脂聯(lián)素mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)及血漿脂聯(lián)素濃度的比較

脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平的比較：OC組顯著低于C組(P<0.01)，AE組顯著高于C組(P<0.01)；OE組顯著高于OC組(P<0.01)；OE組與AE組之間差異無(wú)顯著性(P>0.05，表1)。

脂聯(lián)素蛋白質(zhì)表達(dá)水平的比較：OC組顯著低于C組(P<0.01)，AE組顯著高于C組(P<0.01)；OE組顯著高于OC組(P<0.01)和AE組(P<0.01，圖1，表1)。

血漿脂聯(lián)素濃度比較：OC組、AE組與C組相比差異均無(wú)顯著性(P>0.05)；OE組顯著高于OC組與AE組(P<0.01，P<0.05，表1)。

GroupnAdiponectin mRNAAdiponectin proteinPlasma adiponectinconcentration(μg/L)C56.961±1.7481.284±0.01770.222±5.522OC54.243±0.575**1.069±0.072**64.444±3.239AE69.913±1.170**1.503±0.083**72.685±2.798OE610.644±2.090##1.729±0.058##△△79.722±4.169##△

C： Control group； OC： Obese control group； AE： Aged exercise group； OE： Obese exercise group

**P<0.01vsC group；##P<0.01vsOC group；△P<0.05,△△P<0.01vsAE group

Fig.1Comparison of adiponectin protein expression among the four groups after the experiment

2.2 運(yùn)動(dòng)后老年肥胖大鼠血糖和胰島素抵抗的比較

血糖濃度比較：OC組顯著高于C組(P<0.01)，AE組與C組之間差異無(wú)顯著性(P>0.05)；OE組顯著低于OC組(P<0.05)；OE組與AE組之間差異無(wú)顯著性(P>0.05，表2)。

胰島素抵抗比較：OC組顯著高于C組(P<0.01)，AE組與C組之間差異無(wú)顯著性(P>0.05)；OE組顯著低于OC組(P<0.01)；OE組與AE組之間差異無(wú)顯著性(P>0.05，表2)。

GroupnBlood glucose(mmol/L)Insulin resistanceC511.636±3.56815.880±4.272OC517.930±6.094**24.158±8.001**AE610.635±1.72116.964±4.858OE612.842±1.905#15.403±3.454##

C： Control group； OC： Obese control group； AE： Aged exercise group； OE： Obese exercise group

**P<0.01vsC group；#P<0.05,##P<0.01vsOC group

3 討論

脂聯(lián)素是一種由脂肪細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)類激素，在調(diào)節(jié)胰島素敏感性、葡萄糖和脂質(zhì)代謝方面起著重要作用，同時(shí)還具有抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化等特性[6]。有研究顯示[7]，BMI與血漿脂聯(lián)素濃度密切相關(guān)，13名肥胖但無(wú)疾病者與9名肥胖糖尿病患者在進(jìn)食低能量飲食2個(gè)月后，隨著體質(zhì)量的下降，無(wú)論糖尿病患者還是非糖尿病患者，血漿脂聯(lián)素水平均顯著升高。另有研究表明，大網(wǎng)膜脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)量隨著BMI的升高而下降，肥胖癥患者大網(wǎng)膜脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平顯著降低，這或許與肥胖者易患高血壓、糖尿病等疾病有關(guān)[8-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯低于正常老年大鼠。

近年來(lái)，有關(guān)運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)脂聯(lián)素影響的研究越來(lái)越多。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)均能升高青春期肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)量，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度與表達(dá)量呈正相關(guān)[10]。陳斌等[11]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，6周的運(yùn)動(dòng)干預(yù)能顯著增強(qiáng)胰島素抵抗大鼠脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)，改善胰島素抵抗，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)或許通過(guò)增加脂聯(lián)素的表達(dá)來(lái)改善胰島素抵抗。吳衛(wèi)東等[12]研究顯示，14周有氧運(yùn)動(dòng)能顯著提高ApoE基因缺陷小鼠在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中脂肪組織脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展。說(shuō)明有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)脂聯(lián)素mRNA的作用或許是運(yùn)動(dòng)防治動(dòng)脈粥樣硬化的潛在機(jī)制。Kondo等[13]對(duì)肥胖女性進(jìn)行有氧訓(xùn)練發(fā)現(xiàn)，訓(xùn)練前受試者脂聯(lián)素水平顯著下降，而7個(gè)月的有氧訓(xùn)練能顯著提高其脂聯(lián)素水平。Ryan等[14]對(duì)40名久坐不動(dòng)的超重和肥胖女性進(jìn)行有氧與抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，結(jié)果顯示6個(gè)月的訓(xùn)練顯著降低了體重、BMI、腰圍與臀圍，但血漿脂聯(lián)素水平卻無(wú)明顯變化。本實(shí)驗(yàn)采用運(yùn)動(dòng)處方為15 m/min×15 min為1組，共運(yùn)動(dòng)4組，組間休息5 min，1次/天，5次/周，持續(xù)干預(yù)8周后發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)能明顯提高老年大鼠和老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)，同時(shí)增加血漿脂聯(lián)素濃度。

有研究顯示，肥胖與胰島素抵抗密切相關(guān)，肥胖尤其腹部肥胖是引起胰島素抵抗的重要危險(xiǎn)因素之一[15]。Lim等[16]研究顯示，每天60 min、每周3次、持續(xù)10周的有氧訓(xùn)練能有效升高中青年女性血漿脂聯(lián)素水平，同時(shí)伴隨著胰島素抵抗的降低。超重與肥胖增加胰島素抵抗，大大提高糖尿病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度結(jié)合白藜蘆醇給藥可增加肥胖大鼠胰島素敏感性，降低空腹血糖[17]。姜繼權(quán)等[18]采用Meta分析發(fā)現(xiàn)，不同運(yùn)動(dòng)干預(yù)方式均可對(duì)糖尿病前期人群餐后2 h血糖和胰島素抵抗指數(shù)產(chǎn)生明顯影響，但對(duì)空腹血糖作用不顯著。羅曦娟等[19]研究證實(shí)，有氧或抗阻運(yùn)動(dòng)均可使糖尿病前期人群空腹血糖顯著下降，并在一定程度上使血糖下降至正常水平。劉敏[20]等研究發(fā)現(xiàn)，4周有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能明顯改善肥胖青少年脂肪過(guò)度堆積狀況及胰島素抵抗，對(duì)肥胖青少年心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展具有一定的預(yù)防和延緩作用，同時(shí)還具有良好的抗炎效應(yīng)。許冬明等[21]實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為，血糖的下降可能是通過(guò)影響大鼠體內(nèi)脂聯(lián)素和瘦素的水平，調(diào)節(jié)脂肪代謝和胰島素分泌完成的。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，老年肥胖大鼠的胰島素抵抗和血糖濃度較自然生長(zhǎng)老年大鼠明顯升高，而8周運(yùn)動(dòng)干預(yù)能有效改善胰島素抵抗，降低肥胖老年大鼠的血糖濃度，推測(cè)運(yùn)動(dòng)可能是通過(guò)升高脂聯(lián)素濃度來(lái)降低血糖，從而有利于防治糖尿病的發(fā)生與發(fā)展。

總之，本研究表明，老年肥胖伴隨高血糖和胰島素抵抗、內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)降低；對(duì)老年肥胖大鼠的運(yùn)動(dòng)干預(yù)能顯著增加內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)，升高血漿脂聯(lián)素水平，改善胰島素抵抗，降低血糖。