敖 翔，閔凡祥，白雅梅，呂文河*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，黑龍江 哈爾濱 150086；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

由致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起的晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)中一種極具毀滅性的病害。其最初起源于墨西哥，首次發(fā)現(xiàn)在德國(guó)[1]。1845年，愛爾蘭發(fā)生了惡名昭彰的“愛爾蘭大饑荒”，數(shù)年間病害造成了愛爾蘭數(shù)百萬(wàn)人的死亡和遷移，此次饑荒的罪魁禍?zhǔn)拙褪侵虏∫呙筟2]。隨后，晚疫病迅速傳遍整個(gè)歐洲，并在世界其他馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)開始發(fā)病和流行，對(duì)全球馬鈴薯的產(chǎn)量造成了嚴(yán)重的損失[3]。2012年，中國(guó)大面積爆發(fā)馬鈴薯晚疫病，北方地區(qū)全面流行，南方地區(qū)偏重流行，全國(guó)發(fā)病面積達(dá)265.2萬(wàn)hm2，造成產(chǎn)量損失近300萬(wàn)t[4]。

晚疫病可發(fā)生于馬鈴薯整株，不僅可以侵染植株地上部分，還可使塊莖發(fā)病。馬鈴薯抗晚疫病的鑒定方法有田間抗性鑒定和實(shí)驗(yàn)室抗性鑒定。在實(shí)驗(yàn)室抗性鑒定中，目前多數(shù)學(xué)者利用離體葉片法來(lái)篩選抗病品種或材料[5-7]。但有時(shí)馬鈴薯地上植株與地下塊莖對(duì)晚疫病的抗病性表現(xiàn)并不一致[8-11]。馬鈴薯晚疫病抗病性可分為植株抗性和塊莖抗性。植株抗性表現(xiàn)為地上植株有較強(qiáng)抗病性，但地下塊莖卻表現(xiàn)為感病，易腐爛；塊莖抗性表現(xiàn)為地上植株容易發(fā)病，而地下塊莖則抗病，不易受病菌侵染。長(zhǎng)久以來(lái)，育種家們將育種目標(biāo)主要放在對(duì)馬鈴薯地上葉片抗性的篩選鑒定上，而對(duì)地下塊莖抗性的研究卻較少。感病塊莖無(wú)論在田間還是貯藏期，一旦被侵染極易腐爛，就會(huì)造成嚴(yán)重?fù)p失，若作為種薯播種，還會(huì)成為晚疫病初侵染源進(jìn)一步擴(kuò)散[12]。本研究的目的是通過(guò)室內(nèi)塊莖抗性鑒定方法，對(duì)利用國(guó)外種質(zhì)資源創(chuàng)造的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)良且產(chǎn)量較高的馬鈴薯高世代無(wú)性系進(jìn)行塊莖晚疫病抗性評(píng)價(jià)，進(jìn)而篩選塊莖抗晚疫病的材料，以期為馬鈴薯抗晚疫病育種提供新材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

塊莖晚疫病抗性鑒定所用菌株為KS12-20（1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11）、 SH13-7（1.3.4.7.10.11）、MZ14-20（1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11）、 MZ15-30（1.3.4.7.9.10）和NH12-9（1.4.6.7）共5個(gè)。菌株選擇依據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)結(jié)果，前4個(gè)為2012～2015年黑龍江省當(dāng)年的優(yōu)勢(shì)小種菌株，第5個(gè)為毒力基因數(shù)目相對(duì)較少的菌株，其中KS12-20和MZ14-20為“超級(jí)毒力小種”。

1.1.2 供試馬鈴薯種質(zhì)資源

用于塊莖晚疫病抗性鑒定的馬鈴薯材料共15份，包括1個(gè)感病對(duì)照品種（‘荷蘭15號(hào)’），1個(gè)抗病對(duì)照品種（‘克新18號(hào)’），13個(gè)馬鈴薯高世代無(wú)性系（H17-44049、 H17-44056、 H17-44057、 H17-44107、H17-44114、 H17-44121、 H17-54374、 H17-54316、H17-54071、H17-54113、H17-54229、H17-54280和K17-193）。在這13個(gè)馬鈴薯高世代無(wú)性系中，除 H17-54229（‘中薯 3 號(hào)’בNorland’）外，其他無(wú)性系中至少一個(gè)親本是荷蘭品種或利用荷蘭種質(zhì)資源選育的品種或無(wú)性系。無(wú)性系H17-54229父本‘Norland’是一個(gè)美國(guó)品種。高世代無(wú)性系選擇的標(biāo)準(zhǔn)是農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)良，產(chǎn)量特別是商品薯（≥75 g）產(chǎn)量高。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接種前準(zhǔn)備

用于接種的馬鈴薯塊莖為收獲后存貯在8～9℃下2個(gè)月的無(wú)病無(wú)傷塊莖。將塊莖清洗干凈，用1%次氯酸鈉溶液浸泡30 min進(jìn)行表面消毒，再用滅菌水清洗3遍，將殘留次氯酸鈉溶液消除。每個(gè)塊莖橫向切下2片厚11 mm的塊莖片，用滅過(guò)菌的濾紙吸干表面水分，將薄片放在有濾紙的培養(yǎng)皿中，置于20℃光周期培養(yǎng)箱（16 h光照，8 h黑暗）中愈傷24 h[13]。

1.2.2 接種培養(yǎng)

孢子懸浮液制備：將待測(cè)菌株預(yù)培養(yǎng)10 d，在培養(yǎng)皿中加入適量滅菌水，用涂布棒將孢子囊充分洗出，過(guò)濾吸出液體即為孢子囊懸浮液，4℃環(huán)境下2～3 h待其釋放游動(dòng)孢子即為游動(dòng)孢子懸浮液，利用血球計(jì)數(shù)板將其濃度調(diào)至5×104個(gè)/mL備用。

將用于接種的晚疫病菌株制成孢子懸浮液，取1滴滴在塊莖片的中心，置于保濕保鮮盒中，18℃光周期培養(yǎng)箱高濕黑暗培養(yǎng)7 d后開始調(diào)查。每個(gè)品種8次重復(fù)（4塊莖×2片/塊莖）。設(shè)置陰性對(duì)照，將同等體積滅菌水滴在薯片中心，放置在相同環(huán)境中。

1.2.3 抗性評(píng)分

將單片塊莖翻過(guò)來(lái)進(jìn)行評(píng)分。將薯片下表面切掉薄薄一層，以除去被空氣氧化的褐色，進(jìn)而調(diào)查統(tǒng)計(jì)組織發(fā)病情況。使用DPS 7.31軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，最后用度量感染面積的方法來(lái)確定抗病等級(jí)，抗病等級(jí)參照唐洪明[14]和王騰[15]的標(biāo)準(zhǔn)（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同晚疫病菌株對(duì)馬鈴薯塊莖抗性鑒定

利用5個(gè)菌株對(duì)13個(gè)馬鈴薯無(wú)性系及2個(gè)馬鈴薯品種（對(duì)照）進(jìn)行抗性鑒定，所有陰性對(duì)照均未發(fā)病，說(shuō)明培養(yǎng)環(huán)境沒有晚疫病菌和其他對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響的菌。7 d后對(duì)接種塊莖進(jìn)行侵染面積調(diào)查，結(jié)果顯示不同菌株對(duì)不同馬鈴薯種質(zhì)資源侵染狀況均不同，且差異明顯（表2）。綜合來(lái)說(shuō)，H17-54374侵染面積最?。?.97%），H17-54071侵染面積最大（75.15%）。圖1為SH13-7菌株對(duì)部分馬鈴薯塊莖侵染癥狀。

表2 不同晚疫病菌株對(duì)馬鈴薯塊莖抗性鑒定結(jié)果Table 2 Identification of late blight resistance of potato tubers inoculated with different Phytophthora infestans isolates

圖1 部分馬鈴薯薯片接種菌株SH13-7的癥狀Figure 1 Symptoms of some potato chips inoculated with isolate SH13-7

表3 品種和菌株對(duì)晚疫病菌塊莖侵染面積影響方差分析Table 3 Analysis of variance for effects of potato variety and isolate on infected area of potato chips inoculated with Phytophthora infestans

抗性鑒定結(jié)果方差分析顯示，品種間、菌株間、品種與菌株間的互作效應(yīng)均極顯著（表3），說(shuō)明塊莖侵染面積情況受薯塊品種、侵染菌株以及薯塊品種與侵染菌株互作效應(yīng)影響。

用菌株KS12-20對(duì)塊莖進(jìn)行抗性鑒定，塊莖侵染面積為3.50%～90.00%，其中H17-54374、H17-44056、H17-54113和H17-44057受侵染面積低于抗病對(duì)照‘克新18號(hào)’，但只有H17-54374和H17-44056與抗病對(duì)照差異顯著；H17-54071、H17-54229、H17-44049和H17-44114受侵染面積高于感病對(duì)照‘荷蘭15號(hào)’，但只有H17-54071和H17-54229與‘荷蘭15號(hào)’差異顯著（圖2a）。用菌株SH13-7對(duì)塊莖進(jìn)行抗性鑒定，塊莖侵染面積為3.33%～86.38%，只有H17-54374受侵染面積低于抗病對(duì)照，并差異顯著；H17-54229和H17-54071受侵染面積高于感病對(duì)照，且差異顯著（圖2b）。用菌株MZ14-20對(duì)塊莖進(jìn)行抗性鑒定，塊莖侵染面積為7.25%～90.63%，其中H17-54374、H17-44056和H17-54280受侵染面積低于抗病對(duì)照，但只有H17-54374和H17-44056與抗病對(duì)照差異顯著；H17-44114、H17-54316、H17-54229、H17-54113和H17-54071受侵染面積高于感病對(duì)照，其中除H17-54071外均與‘荷蘭15號(hào)’差異顯著（圖2c）。用菌株MZ15-30對(duì)塊莖進(jìn)行抗性鑒定，塊莖侵染面積為1.25%～74.50%，H17-44056、H17-54374和H17-54280受侵染面積低于抗病對(duì)照，但只有H17-44056和H17-54374與抗病對(duì)照差異顯著；H17-54071受侵染面積高于感病對(duì)照，但差異不顯著（圖2d）。用菌株NH12-9對(duì)塊莖進(jìn)行抗性鑒定，塊莖侵染面積為1.00%～73.75%，其中 H17-54374、H17-44056、H17-44121、H17-44107和H17-44280受侵染面積低于抗病對(duì)照，但只有H17-54374和H17-44056與抗病對(duì)照差異顯著；H17-54316、H17-44114、H17-54071和H17-54229受侵染面積高于感病對(duì)照，且均與‘荷蘭15號(hào)’差異顯著（圖2e）。雖然品種和菌株互作效應(yīng)極顯著，但仔細(xì)考察圖2中的數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，不同品種對(duì)被測(cè)株系反應(yīng)總的趨勢(shì)還是一致的，特別是無(wú)性系H17-54374和H17-44056對(duì)接種5個(gè)株系的反應(yīng)均較抗病。

圖2 不同菌株對(duì)馬鈴薯塊莖的侵染面積Figure 2 Infested area of potato tubers inoculated with different isolates

5個(gè)菌株中，MZ14-20和KS12-20致病力最強(qiáng)，但KS12-20和SH13-7差異不顯著。NH12-9致病力最弱（圖3a）。13個(gè)無(wú)性系間，H17-54374和H17-44056受侵染面積低于抗病對(duì)照，且與其差異顯著；H17-54071、H17-54229和H17-44114受侵染面積高于感病對(duì)照，且與其差異顯著（圖3b）。

2.2 馬鈴薯種質(zhì)資源的抗性類型劃分

圖3 不同菌株和不同品種（無(wú)性系）的平均侵染面積Figure 3 Average infested area of different isolates and different varieties(clones)

表4 馬鈴薯種質(zhì)資源的抗性類型劃分Table 4 Classification of resistance type of potato germplasm resources

對(duì)13份馬鈴薯高世代無(wú)性系進(jìn)行薯片抗性鑒定，未發(fā)現(xiàn)0級(jí)材料，發(fā)現(xiàn)1級(jí)材料1份、2級(jí)材料1份、3級(jí)材料1份、4級(jí)材料6份、5級(jí)材料4份（表4）。其中抗病對(duì)照品種‘克新18號(hào)’抗病等級(jí)為3級(jí)，感病對(duì)照品種‘荷蘭15號(hào)’抗病等級(jí)為5級(jí)。對(duì)照抗性類型進(jìn)行劃分，發(fā)現(xiàn)高抗材料1份（H17-54374）， 中抗 材 料 2份（H17-44056和H17-54280），抗性材料占所有無(wú)性系的23.08%；感 病 材 料 6 份（H17-44121、 H17-44057、H17-44107、H17-44049、H17-54113和K17-193），占所有無(wú)性系的46.15%；高感材料4份（H17-54316、H17-44114、H17-54229和H17-54071），占所有無(wú)性系的30.77%。

3討 論

培育抗晚疫病品種是防治晚疫病最經(jīng)濟(jì)有效的方法，而篩選馬鈴薯種質(zhì)資源是培育抗晚疫病品種的關(guān)鍵步驟。目前多數(shù)抗晚疫病種質(zhì)資源篩選的研究均采取田間自然抗性或者室內(nèi)離體葉片的方法進(jìn)行鑒定，對(duì)塊莖抗性鑒定的報(bào)道較少。由于受不同基因控制，有時(shí)馬鈴薯地上植株與地下塊莖對(duì)晚疫病的抗病性經(jīng)常表現(xiàn)不一致[16]，如果馬鈴薯葉片對(duì)晚疫病表現(xiàn)抗性不一定就說(shuō)明塊莖也表現(xiàn)抗性。地下塊莖是馬鈴薯的主要經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量，在植株葉片抗病的前提下，利用塊莖抗性鑒定方法來(lái)篩選種質(zhì)資源更為直接、可靠。Dorrance和Inglis[13]利用田間整薯抗性鑒定、室內(nèi)整薯塊莖鑒定和室內(nèi)塊莖薄片鑒定3種方法對(duì)不同馬鈴薯品種進(jìn)行了抗性鑒定。有些學(xué)者利用室內(nèi)塊莖薄片鑒定方法鑒定塊莖的抗病性，部分原因是該方法可以忽視掉薯皮對(duì)致病疫霉的抗性活動(dòng)，這樣可以更清晰的明確薯塊抗性[17,18]。

本研究采用的5個(gè)菌株中有4個(gè)為4年的優(yōu)勢(shì)小種，且2年的優(yōu)勢(shì)小種為超級(jí)毒力小種，另，也包括了含有致病基因最少的小種。MZ14-20和KS12-20均是超級(jí)毒力小種，兩者的致病力均較強(qiáng)，但MZ14-20致病力顯著高于KS12-20的致病力，說(shuō)明不同的遺傳背景可能會(huì)影響病原菌的致病力，具體原因需進(jìn)一步研究，所以菌株的選擇多樣性會(huì)對(duì)抗性鑒定結(jié)果產(chǎn)生一定影響。

荷蘭是馬鈴薯育種大國(guó)，亦是種薯出口大國(guó)。荷蘭馬鈴薯塊莖均勻、芽眼淺，多為橢圓形、卵圓形。例如‘Favorita’，具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等特點(diǎn)，但抗病性，如晚疫病抗性較差。本研究試驗(yàn)材料除一個(gè)無(wú)性系外，其余材料雙親中至少有1個(gè)是荷蘭馬鈴薯品種或用荷蘭馬鈴薯種質(zhì)資源選出的無(wú)性系，但并沒有對(duì)其塊莖進(jìn)行晚疫病抗性鑒定。本研究對(duì)2個(gè)馬鈴薯品種（‘克新18號(hào)’和‘荷蘭15號(hào)’）和13個(gè)馬鈴薯高世代無(wú)性系進(jìn)行塊莖抗性鑒定，其中2個(gè)馬鈴薯品種的鑒定結(jié)果與王騰[15]的報(bào)道結(jié)果一致，從13個(gè)馬鈴薯高世代無(wú)性系篩選出了3個(gè)作為抗晚疫病種質(zhì)資源進(jìn)行進(jìn)一步的育種工作，同時(shí)為挖掘新的抗晚疫病基因研究提供原材料。