池愛平， 王子楠， 史 兵， 楊小帆， 閔瑞欣， 宋 婧

(陜西師范大學(xué)體育學(xué)院， 西安 710119)

慢性疲勞綜合癥(chronic fatigue syndrome，CFS)屬于一種重度的亞健康狀態(tài)，是一組以長期持續(xù)疲勞為突出表現(xiàn)，同時伴有以注意力不集中、記憶力下降、低熱、頭痛、咽喉痛、肌肉關(guān)節(jié)痛、睡眠障礙和抑郁等非特異性表現(xiàn)為主的一組征候群[1]。長期的工作學(xué)習(xí)壓力、精神壓力、睡眠不足、運(yùn)動不足、性格內(nèi)向以及人際關(guān)系不和諧等多種原因都是CFS的誘因。目前國際上診斷CFS的依據(jù)是美國疾病控制中心1994年(CDC-1994)修訂的標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)主要包括：持續(xù)或反復(fù)出現(xiàn)6個月及以上、非勞累引起的嚴(yán)重疲勞，經(jīng)休息后不能緩解；并且在下列8項(xiàng)癥狀中至少滿足4項(xiàng)：(1)短時記憶力下降或注意力難以集中，(2)咽喉痛，(3)頸部或腋窩淋巴結(jié)腫大，(4)肌痛，(5)多發(fā)性關(guān)節(jié)痛，(6)頭痛，(7)睡體體，正處于生長發(fā)育的關(guān)鍵時期，同時面臨升學(xué)壓力和長期、緊張的學(xué)習(xí)生活節(jié)奏，極易成為CFS群體。CFS會導(dǎo)致青少年記憶力減退、學(xué)習(xí)成績下降，嚴(yán)重影響其身體發(fā)育與體質(zhì)健康。此外研究還顯示，CFS如能得到及時診治，其康復(fù)的可能性就較大；但持續(xù)時間越長越難治愈，可對患者的身體和心理健康造成不可估量的危害，最終導(dǎo)致器質(zhì)型疾病的發(fā)生[2]，而且CFS還可導(dǎo)致機(jī)體在大強(qiáng)度運(yùn)動后猝死[3]?？梢奀FS對青少年群體的危害不容忽視。對青少年CFS群體進(jìn)行監(jiān)測與防治，是目前青少年健康管理與促進(jìn)的任務(wù)之一。青少年CFS有別于成人，具有自己的特點(diǎn)，根據(jù)其癥狀的復(fù)雜性，診斷時要考慮許多變異。研究發(fā)現(xiàn)，易疲勞、頭痛、睡眠障礙、情緒問題、對聲音敏感和認(rèn)知困難是青少年CFS的常見癥狀[4]。

代謝產(chǎn)物能夠在一個生物體的細(xì)胞器、細(xì)胞、組織、器官、體液等各個層面上產(chǎn)生[5]，從某種意義上說，機(jī)體的每一項(xiàng)生命活動都要受到代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)和影響。代謝組學(xué)是一種研究體內(nèi)代謝產(chǎn)物的系統(tǒng)生物學(xué)方法，重點(diǎn)考查的是機(jī)體內(nèi)分子量在1000D以內(nèi)的小分子代謝物質(zhì)。對于CFS人群而言，代謝組學(xué)研究可以篩選其特異性標(biāo)志物，探索其發(fā)病機(jī)制。在代謝物的選擇上，由于尿液采樣方便、對機(jī)體無損傷，常作為許多疾病診斷的目標(biāo)物[6]。此外，運(yùn)動后人體生理功能的變化和代謝系統(tǒng)的變化均較安靜時更明顯，此時檢測機(jī)體的生理功能和代謝標(biāo)志物往往能獲得很多潛在的生物指標(biāo)變化特征[7]。本研究旨在探析中學(xué)生CFS的代謝機(jī)制，為進(jìn)一步完善CFS的生物學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。由于CFS可導(dǎo)致機(jī)體在大強(qiáng)度運(yùn)動后猝死[8]，本研究采用中等強(qiáng)度的哈佛臺階運(yùn)動作為運(yùn)動干預(yù)方式，以確保受試者安全[9]。

1 對象與方法

1.1 研究對象

為了盡可能降低外界因素對差異代謝物檢測的影響，本實(shí)驗(yàn)選取符合CDC-1994診斷標(biāo)準(zhǔn)的某高中8名全封閉管理的高三學(xué)生作為試驗(yàn)組(CFS組)，同時選取8名同年級同性別的健康學(xué)生作為對照組。針對哈佛臺階實(shí)驗(yàn)的操作特點(diǎn)，受試對象全部為男性，學(xué)生基本情況見表1。

GroupAge(y)Height(cm)Weight(kg)Control18±1173.36±4.2170.63±6.92CFS18±1172.54±3.9871.54±5.81

1.2 運(yùn)動方式與尿液采集

受試者均為本地高三補(bǔ)習(xí)學(xué)校學(xué)生，測試前3天統(tǒng)一其作息、飲食，不允許吸食煙酒以及其他刺激性食物，并且避免參加體育活動。測試當(dāng)天早晨，采集受試者的中段晨尿2 ml；下午3點(diǎn)進(jìn)行中等強(qiáng)度的哈佛臺階實(shí)驗(yàn)，上下臺階踏步頻率為70次/min。考慮到在中等強(qiáng)度運(yùn)動中，參與物質(zhì)代謝的主要有磷酸原、糖和氨基酸三個代謝系統(tǒng)，其代謝產(chǎn)物進(jìn)入血液最終形成尿液成分的時間為2～3 h[10]，因此第二次采集尿樣時間設(shè)定為運(yùn)動后3 h，采樣量2 ml。采集的尿液樣本置于液氮灌中，隨后轉(zhuǎn)存于-80℃低溫冰箱待測。

1.3 樣品的LC-MS法檢驗(yàn)

在室溫下融化尿液樣品，吸取100 μl至1.5 ml離心管中，加入300 μl甲醇，渦旋震蕩充分混勻，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取200 μl上清用于LC-MS檢測。儀器分析平臺為LC-Q/TOF-MS (Agilent,1290 InfinityLC, 6530 UHD和Accurate-Mass Q-TOF/MS)；分離色譜柱為C18色譜柱(Agilent, 100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；色譜分離條件為：柱溫40℃；流速0.35 ml/min；流動相組成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸。質(zhì)譜條件：采用正離子模式進(jìn)行；檢測條件：以氮?dú)庾鳛殪F化、錐孔氣；飛行管檢測模式V型。正離子模式條件為：毛細(xì)管電壓4 kV、錐孔電壓35 kV、離子源溫度100℃；脫溶劑氣溫度350℃、反向錐孔氣流50 L/h、脫溶劑氣600 L/h、萃取錐孔4 V。

1.4 數(shù)據(jù)的多維統(tǒng)計(jì)分析

參考相關(guān)文獻(xiàn)[11-15]，對所得到的各組樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)行主成分(principal component analysis，PCA)分析。以此來獲得得分矩陣圖(score scatter plot)和加載矩陣圖(loading scatter plot)。根據(jù)加載矩陣中各變量對主成分貢獻(xiàn)的大小可以判斷生物標(biāo)志物。為排除干擾因素，獲得更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，對PCA分析完的數(shù)據(jù)再次進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA)，以過濾除去無關(guān)數(shù)據(jù)，得到可靠的差異代謝物數(shù)據(jù)。同時統(tǒng)計(jì)對模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)，以此驗(yàn)證所建立的模型是否符合樣本數(shù)據(jù)的真實(shí)情況。

1.5 數(shù)據(jù)處理

經(jīng)過LC-MS法檢測之后，利用SIMCA軟件(V14, Umetrics AB, Umea, Sweden)對歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元變量模式識別分析。對樣本進(jìn)行主成分分析能從總體上反映各組樣本之間的總體差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。采用PCA、OPLS-PA多維統(tǒng)計(jì)處理，以差異代謝物對本組的貢獻(xiàn)值(variable importance in the projection，VIP)和t-檢驗(yàn)概率值P作為差異代謝物的篩選指標(biāo)，即VIP>1且P<0.05作為標(biāo)準(zhǔn)篩選潛在的差異代謝物。所有化合物都通過京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行潛在的生物標(biāo)志物的篩選，再將篩選出來的生物標(biāo)志物輸入MetPA數(shù)據(jù)庫(http://metpa.metabolomics)中，分析相應(yīng)的代謝通路。

2 結(jié)果

2.1 LC-MS法檢測的質(zhì)譜圖分析

將對照組和CFS組的所有樣品混合在一起，得到兩組的LC-MS總離子流重疊色譜圖(TIC)，如圖1所示。

圖1是在正離子模式下取得的對照組和CFS組混樣LC-MS總離子流的重疊色譜圖。結(jié)果表明，兩組共檢測到1491個物質(zhì)峰。從對照組(圖1A)和CFS組(圖1B)的總離子流的重疊色譜圖來看，兩組的物質(zhì)峰群存在較大的差異，說明CFS組學(xué)生與對照組學(xué)生的尿液代謝物中存在較多的差異代謝物。因此，有必要對其作進(jìn)一步分析。另外，兩組總離子流重疊色譜圖的物質(zhì)峰都非常整齊，保留時間重現(xiàn)性非常好，說明本研究采用的LC-MS儀器穩(wěn)定性較高，分析和數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性非常高。

Fig.1Total ion chromatograms of the urine samples obtained from the subjects in chronic fatigue syndrome (CFS) and control groups.

A: Control group; B: CFS group

2.2 PCA和OPLS-DA分析結(jié)果

運(yùn)動前后CFS組學(xué)生與對照組學(xué)生尿液代謝物的PCA和OPLS-DA分析結(jié)果如圖2所示。

Fig.2Principal componentanalysis (PCA) and orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis (OPLS-DA) of urine metabolitesfrom the subjects in CFS and control groups

A: Pre-exercise (a: PCA score; b: OPLS-DA score); B: Post-exercise (a: PCA score; b: OPLS-DA score)

圖2A表示運(yùn)動前CFS組與對照組的PCA和OPLS-DA得分結(jié)果比較，圖2B表示運(yùn)動后CFS組與對照組的PCA和OPLS-DA得分結(jié)果比較。圖中每個點(diǎn)代表一個樣品，樣品在圖中的坐標(biāo)由其所包含的成分決定，也就是樣品分布的差異由其成分的差異決定。不管是運(yùn)動前還是運(yùn)動后，CFS組和對照組樣本分布在各個象限，表明只靠PCA分析不能達(dá)到明顯的分離效果，需要對樣本進(jìn)一步采用有監(jiān)督方式的OPLS-DA進(jìn)行分析。通過OPLS-DA過濾掉不相關(guān)的正交信號，因而獲得的差異性代謝物更加可靠。從OPLS-DA得分圖可看出，運(yùn)動前與運(yùn)動后的組間樣本對比中，對照組樣本分布在Ⅱ、Ⅲ象限，而CFS組樣本分布在Ⅰ、Ⅳ象限，兩組樣本分布非常整齊，分離效果非常明顯。OPLS-DA得分能夠很好地反映出組內(nèi)尿液的相似性和組間樣品的差異性，說明不論運(yùn)動前還是運(yùn)動后，CFS組學(xué)生尿液代謝物與對照組學(xué)生尿液代謝物存在較大的差異。

2.3 潛在差異代謝物的篩選

通過OPLS-DA分析，CFS組與對照組所有化合物都通過KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異代謝物篩選。篩選結(jié)果必須同時滿足以下3個條件：(1)差異代謝物對本組的貢獻(xiàn)值VIP大于1；(2)與KEGG數(shù)據(jù)庫對應(yīng)物質(zhì)的相似度大于700；(3)與對照組比較，CFS組差異代謝物含量具有顯著性差異(P<0.05)。滿足上述條件的差異代謝物才能最終入選。最終結(jié)果顯示，運(yùn)動前CFS組篩選得到4個差異代謝物，分別是肌酸、吲哚乙醛、植物鞘氨醇和焦谷氨酸(表2)。這4個代謝物依次涉及到精氨酸-脯氨酸代謝、色氨酸代謝、鞘脂類代謝和谷胱甘肽代謝。同樣，與對照組比較，運(yùn)動后CFS組得到11個差異代謝物，依次是壬二酸、甲基腺苷、乙酰肉堿、癸酸、皮質(zhì)酮、肌酸、左炔諾孕酮、泛酸、焦谷氨酸、黃嘌呤核苷和黃尿酸，這些差異代謝物主要與氨基酸代謝、能量代謝、類固醇激素生物合成和嘌呤代謝等相關(guān)。

Tab. 2 Differential metabolites of CFS students before and after exercise

a(↑): Up-regulated; (↓): Down-regulated

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.4 代謝通路分析

將檢出的15個差異代謝物(表2)輸入MetPA數(shù)據(jù)庫，對其所涉及的代謝通路進(jìn)行權(quán)重分析。以得分>0.01為閾值，對這些代謝通路進(jìn)行篩選，高于此值為CFS的潛在靶標(biāo)通路。圖3結(jié)果顯示，與對照組比較，運(yùn)動前CFS組的代謝紊亂與精氨酸-脯氨酸代謝紊亂相關(guān)(圖3A)。在運(yùn)動后的對比中，CFS組除了精氨酸-脯氨酸代謝紊亂依然存在之外，又檢測到泛酸與輔酶A生物合成、類固醇激素生物合成兩條代謝通路存在障礙(圖3B)。

3 討論

慢性疲勞綜合征是一種較為嚴(yán)重的持續(xù)性疲勞，患者的癥狀主要有乏力、身體某些部位疼痛、記憶認(rèn)知能力下降以及抗病能力差等。研究報(bào)道顯示，CFS的這些癥狀與能量代謝紊亂[16]、免疫功能紊亂[17]以及下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸功能減退等有關(guān)[18]。本課題組前期建立了CFS動物模型，探索了CFS發(fā)病的代謝機(jī)制，我們的研究結(jié)果顯示：CFS機(jī)體的代謝障礙主要發(fā)生在三羧酸循環(huán)、谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸代謝、類固醇生物合成三條代謝通路上[19]。為了驗(yàn)證基礎(chǔ)研究的結(jié)果，本次經(jīng)過嚴(yán)格篩選與控制，對8名CFS中學(xué)生進(jìn)行了代謝障礙機(jī)制的探索。該群體學(xué)習(xí)壓力與思想壓力都很大，同時存在睡眠不足或睡眠質(zhì)量差等問題，進(jìn)而影響其認(rèn)知與記憶能力，導(dǎo)致學(xué)習(xí)成績下降。

Fig.3Impact score of the metabolic pathways of CFS students in pre- and post-exercise

A: Pre-exercise (a: Arginine and proline metabolism); B: Post-exercise (a: Arginine and proline metabolism; b: Biosynthesis of pantothenate and CoA; c: Steroid hormone biosynthesis)

本研究采用LC-MS法，對CFS中學(xué)生運(yùn)動前后采集的尿液進(jìn)行系列檢測與數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明，在非運(yùn)動狀態(tài)下，CFS組的代謝紊亂只與精氨酸-脯氨酸代謝紊亂相關(guān)；而在運(yùn)動后，CFS組除依然存在精氨酸-脯氨酸代謝紊亂外，還與泛酸與輔酶A生物合成、類固醇激素生物合成兩條代謝通路障礙有關(guān)。本次研究結(jié)果與前期研究結(jié)果均證實(shí)，CFS機(jī)體存在類固醇生物合成降低現(xiàn)象，這與該代謝通路中的關(guān)鍵差異代謝物皮質(zhì)酮含量的減少有關(guān)。已有研究證實(shí)，CFS患者皮質(zhì)酮含量下降是由于其HPA軸功能紊亂所致[18,20]。皮質(zhì)酮是HPA軸分泌的主要類固醇激素之一，對人體免疫能力、認(rèn)知能力、學(xué)習(xí)能力以及記憶能力有影響[21]。因此CFS組中學(xué)生表現(xiàn)出的注意力無法集中或記憶力減退現(xiàn)象，可能與HPA軸功能紊亂有關(guān)。

而與動物模型不同的是，本次研究結(jié)果顯示CFS組中學(xué)生的另外兩個代謝系統(tǒng)出現(xiàn)障礙，即精氨酸-脯氨酸代謝、泛酸-輔酶A生物合成。上述兩個代謝通路中的關(guān)鍵差異代謝物依次為肌酸和泛酸。肌酸在肌肉能量代謝中起著重要的作用，可以儲存或補(bǔ)充ATP[22]。CFS患者體內(nèi)ATP含量較低是其感到乏力的原因之一。泛酸是輔酶A生物合成的前體物質(zhì)，后者參與生物體內(nèi)的糖代謝、脂代謝、蛋白質(zhì)代謝，也影響腎上腺皮質(zhì)的機(jī)能和能量代謝。泛酸含量降低會影響機(jī)體的抵抗力[23]。本研究結(jié)果顯示，CFS組中學(xué)生運(yùn)動后體內(nèi)的泛酸含量顯著低于對照組，進(jìn)而導(dǎo)致其能量代謝水平下降，運(yùn)動能力降低。本研究結(jié)果顯示，CFS組中學(xué)生的臺階指數(shù)顯著低于對照組，這可能與其機(jī)體差異代謝物肌酸和泛酸顯著降低有關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致其精氨酸-脯氨酸代謝紊亂和泛酸-輔酶A生物合成受阻。

綜上所述，精氨酸-脯氨酸代謝紊亂是CFS的代謝紊亂機(jī)制之一；除此之外，在給CFS中學(xué)生施加一個中等強(qiáng)度的運(yùn)動后，能夠檢測出另外兩個代謝通路障礙，即類固醇激素代謝障礙、泛酸-輔酶A生物合成障礙。肌酸、皮質(zhì)醇和泛酸是CFS患者的潛在生物標(biāo)記物。上述結(jié)果為進(jìn)一步探索CFS中學(xué)生臨床癥狀的生理和病理機(jī)制提供了理論依據(jù)。