朱雅冰， 賈改麗， 陸嘉輝， 張茂表， 李 軍， 曹 紅

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科， 浙江 溫州 325027)

根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)統(tǒng)計(jì)，至2015年全球大約有4.15億糖尿病患者，2040年將達(dá)到6.42億，其中2型糖尿病患者占90%以上[1]。糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，發(fā)病率高達(dá)50%[2]，其中30%以上的患者會(huì)出現(xiàn)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛 (diabetic neuropathic pain，DNP)[3-5]，臨床上表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和異常性疼痛[1]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。自噬作為一種清除細(xì)胞內(nèi)衰老蛋白和損傷細(xì)胞器的保護(hù)性機(jī)制，被認(rèn)為參與2型糖尿病的形成[6]。最近研究表明，大鼠脊髓自噬激活參與腹腔單次注射STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛模型的形成[7]。雖然1型糖尿病和2型糖尿病所產(chǎn)生的神經(jīng)性疾病在癥狀上十分相似，但其機(jī)制有本質(zhì)的差別[8,9]。脊髓自噬是否參與2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛尚未見報(bào)道，因此本研究采用高糖高脂飲食復(fù)合腹腔注射小劑量STZ誘導(dǎo)2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛模型，通過檢測(cè)自噬標(biāo)記物在2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中的表達(dá)，探討自噬在2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

抗LC3抗體，抗P62抗體，抗GFAP抗體，抗OX-42抗體，抗DAPI抗體購(gòu)于Abcam公司；抗Beclin-1抗體，抗P62抗體購(gòu)于CST公司；抗NeuN抗體購(gòu)于Millipore公司；Alexa Fluor?546驢抗小鼠IgG，Alexa Fluor?488驢抗兔IgG 購(gòu)于Invitrogen公司。

1.2 動(dòng)物模型制備及分組

雄性清潔級(jí)SD大鼠，體重(120～160) g，購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按照隨機(jī)數(shù)字表法[10]，將大鼠分為C組 (普通飼料喂養(yǎng)，n=18)，D組 (高糖高脂飼料喂養(yǎng)，n=42)。實(shí)驗(yàn)開始及飼養(yǎng)第8周測(cè)體重、空腹血糖。第8周末，采大鼠尾靜脈血測(cè)胰島素水平并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)；測(cè)大鼠的機(jī)械縮足閾值 (mechanical withdrawal threshold，MWT) 和熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)，記作基礎(chǔ)值。第9周，D組大鼠按35 mg/kg的劑量單次腹腔注射STZ，3 d后血糖穩(wěn)定且≥16.7 mmol/L則認(rèn)為2型糖尿病模型大鼠造模成功，第11周再次測(cè)定大鼠MWT和TWL，數(shù)值降至基礎(chǔ)值80%以下者為2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠[11-13]，記為DNP組；數(shù)值未降至基礎(chǔ)值80%以下者為2型糖尿病無神經(jīng)病理性疼痛大鼠，記為DA組。

1.3 胰島素測(cè)定及胰島素敏感性指數(shù)計(jì)算

采大鼠尾靜脈血1 ml，4℃離心30 min取上清液，使用雙抗體夾心ELISA法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)量樣本胰島素濃度，計(jì)算胰島素敏感指數(shù) (insulin sensitivity index，ISI)。ISI=1/(空腹血糖×空腹胰島素濃度)，由于此值系非正態(tài)分布，故取其自然對(duì)數(shù)[14]。

1.4 行為學(xué)測(cè)試

分別于注射STZ前、注射STZ 2周后及確定分組后第3、7、14天，測(cè)定機(jī)械縮足閾值 (MWT) 和熱縮足潛伏期 (TWL)。測(cè)定在安靜環(huán)境下進(jìn)行，測(cè)定時(shí)間固定在8:00-16:00。

1.4.1 機(jī)械縮足閾值測(cè)定 參照文獻(xiàn)方法[15]使用IITC-2390型觸覺測(cè)痛儀 (Electronic Von Fery, IITC公司，美國(guó)) 測(cè)定MWT：待大鼠安靜后，垂直刺激大鼠后趾，單次刺激時(shí)間≤1 s，間隔10 s。大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為為陽性反應(yīng)，記錄此時(shí)的刺激強(qiáng)度值，測(cè)定5次，除去最大值與最小值，計(jì)算其余3次的平均值作為其MWT。

1.4.2 熱縮足潛伏期測(cè)定 將大鼠置于透明玻璃箱中，安靜后用IITC336甩尾足底測(cè)試儀 (IITC公司，美國(guó)) 測(cè)定TWL。使用測(cè)試儀的光源照射后趾，記錄從照射到出現(xiàn)大鼠抬足或舔足等回避行為的時(shí)間間隔，雙足各測(cè)定5次，每次測(cè)量間隔5 min，去除最大值和最小值，計(jì)算其余3次的平均值作為其TWL。

1.5 脊髓背角微管輕鏈相關(guān)蛋白(LC3)、Beclin-1和P62檢測(cè)

各時(shí)間點(diǎn)行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后，每組隨機(jī)抽取6只大鼠，5%水合氯醛麻醉，取大鼠L4～L6節(jié)段脊髓，加入裂解液研磨，超聲處理5 min～3次，4℃離心30 min，使用BCA法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)濃度。用8%膠濃度作SDS-PAGE分離上樣緩沖液，轉(zhuǎn)移到孔徑0.45 μm PVDF膜上，常溫封閉2 h。加入抗LC3 (1∶1 000，Abcam)、抗Beclin-1 (1∶500，CST)和抗P62 (1∶1 000，CST)單克隆抗體，4℃過夜。室溫下用TBST洗10 min×3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，用TBST洗10 min×3次。使用DNR Miro Chemi化學(xué)發(fā)光法曝光、拍照，采用Quantity One軟件分析，以與內(nèi)參β-actin吸光度的比值反映LC3-I、LC3-II、Beclin-1和P62的表達(dá)水平。

1.6 免疫熒光

5%水合氯醛 (350 mg/kg，Sigma) 麻醉分組7 d DNP組大鼠，用0.9%氯化鈉溶液200 ml心臟沖洗后，用20℃含4%多聚甲醛的0.01 mol/L的PBS 400 ml灌注。在L4～L6脊髓膨大處，取長(zhǎng)約2 cm的脊髓組織，置4℃含4%甲醛的0.01 mol/L的PBS中固定4～8 h，依次放于10%、20%、30%蔗糖溶液中脫水12 h。OTC包埋劑包埋脊髓組織，于-20℃恒溫冰凍切成10 μm厚切片，用0.01 mol/L PBS清洗20 min×3次。在37℃恒溫箱中用封閉液 (含0.3% Triton、3%驢血清、0.01 mol/L PBS) 封閉1 h，將抗P62抗體 (1∶100) 分別與抗GFAP抗體 (1∶1 000)、抗OX-42抗體 (1∶200) 和抗NeuN抗體 (1∶500) 于4 ℃孵育12 h，常溫下復(fù)溫1 h，用0.01 mol/L PBS在搖床上清洗10 min×3次。加Alexa Fluor? 546 驢抗小鼠IgG、Alexa Fluor?488驢抗大鼠IgG (1∶1 000) 置37 ℃恒溫箱中避光孵育2 h，用0.01 mol/L PBS清洗10 min×3次，DAPI (Abcam) 染色5 min，再次用0.01 mol/L PBS清洗10 min×3次，熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察切片、Image-Pro Plus 軟件分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠血糖、胰島素和胰島素敏感性指數(shù)

實(shí)驗(yàn)8周后，與C組相比，D組大鼠的體重明顯增加 (P<0.05，圖1)；血糖升高，但尚未達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)(≥16.7 mmol/L)；大鼠空腹胰島素水平增加 (P<0.05)，胰島素敏感性指數(shù)(ISI)下調(diào) (P<0.05，表1)，提示出現(xiàn)胰島素抵抗。D組大鼠在注射STZ 3 d后，血糖明顯上升(P<0.05，表1)

2.2 痛閾變化

與C組、DA組比較，DNP組第3、7和14天時(shí)MWT降低，TWL縮短 (P<0.05)，且C組與DA組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。表明部分2型糖尿病大鼠出現(xiàn)觸痛異常和熱痛過敏。

Fig.2Mechanical withdrawal threshold and thermal withdrawal latency of rats in the three groups at different observation points

Note: The ‘0’ on the abscissa represents the base value, ‘14’ means on the 14th day after STZ injection; ‘17’, ‘21’ and ‘28’ mean on the 3rd, the 7th and the 14th day after grouping respectively

*P<0.05vsC group;#P<0.05vsDA group

2.3 脊髓背角LC3、Beclin-1和P62表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與C組相比，DA組LC3-II水平明顯增高 (P<0.05)，表明自噬體合成增加，但DA組P62、Beclin-1水平與C組相比無明顯差異。與C組相比，DNP組LC3-II、Beclin-1水平明顯增高 (P<0.05)，并且P62表達(dá)下降 (P<0.05)，表明DNP組大鼠脊髓自噬功能激活。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，DNP組大鼠LC3-II水平較DA組明顯增高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，表明DNP組大鼠自噬水平可能比DA組大鼠高。LC3-I的表達(dá)量在三組大鼠之間無明顯改變 (P>0.05，圖3)。

GroupFasting blood glucose (mmol/L)0 week8th weekend3 d after STZ injectionInsulin levels (mIU/L)8th weekendISI (insulin sensitivity index) 8th weekendC3.06±0.423.93±0.483.95±0.6516.29±2.90-4.13±0.17D2.95±0.465.76±0.9729.83±3.10*40.07±7.64*-5.41±0.25*

C: Normal group; D: The group of rats fed with high sugar and high fat diet

*P<0.05vsC group

Fig.3The expression of LC3-I、LC3-II、Beclin-1 and P62 in the spinal cord

*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup DA

2.4 脊髓背角P62與星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元熒光雙染

目前，免疫熒光抗體并不能很好地區(qū)分LC3-I和LC3-II，因此選擇自噬底物P62研究2型糖尿病大鼠中自噬體的細(xì)胞定位。免疫熒光結(jié)果顯示，P62表達(dá)于脊髓背角且主要與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN共存，少部分P62與小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物OX42共存，幾乎不與星形細(xì)胞標(biāo)志物GFAP共定位(圖4，見彩圖頁Ⅱ)。表明2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓自噬功能的活化主要發(fā)生在神經(jīng)元中，少部分出現(xiàn)在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。

3 討論

雖然1型糖尿病和2型糖尿病產(chǎn)生的神經(jīng)性疾病的癥狀十分相似，但其發(fā)病機(jī)制有著本質(zhì)差別[8,9]。在1型糖尿病患者，控制血糖能有效緩解神經(jīng)癥狀；但在2型糖尿病患者，控制血糖的作用起效甚微[16]。在臨床上的糖尿病人群中，只有5%～10%為1型糖尿病，2型占了約90%[17]。本研究采用高糖高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗復(fù)合腹腔小劑量注射STZ的方法制備了2型糖尿病神經(jīng)病理性痛大鼠模型[11-13]，與單次大劑量注射STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病模型相比，更具有臨床意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與C組、DA組相比，DNP組MWT下降，TWL縮短，表明部分2型糖尿病大鼠出現(xiàn)神經(jīng)病理性疼痛。

自噬是一種維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的保護(hù)機(jī)制，例如細(xì)胞質(zhì)，蛋白質(zhì)和細(xì)胞器流通周轉(zhuǎn)[18]。一系列環(huán)境應(yīng)激和細(xì)胞應(yīng)激，如營(yíng)養(yǎng)缺乏、免疫刺激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生[19]。正常條件下自噬保持在較低的基礎(chǔ)水平[20]，在代謝性疾病[21]、神經(jīng)退行性疾病[22,23]、炎癥性疾病[24]以及癌癥[25]等病理情況下會(huì)出現(xiàn)自噬功能失調(diào)。其中，自噬作為2型糖尿病病理進(jìn)展的重要參與者被廣泛研究，并被指出是一種新的治療靶點(diǎn)[6]。神經(jīng)病理性疼痛是2型糖尿病的常見并發(fā)癥，研究表明自噬在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[26]，但自噬是否參與2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛尚未可知。

在酶的分解和酯化作用下，胞質(zhì)型微管相關(guān)蛋白1的輕鏈亞基 (microtubule-associated protein-1 light-chain 3)即LC3-I轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば?，即LC3-Ⅱ，LC3-II被納入自噬體[27]，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，組裝自噬體[28]。LC3-II的含量增加常表示細(xì)胞自噬功能增強(qiáng)，因此認(rèn)為L(zhǎng)C3-II是評(píng)價(jià)自噬激活的生物標(biāo)志物[29]。但LC3-II增加可以由自噬誘導(dǎo)產(chǎn)生，也可以由后期任意步驟(例如與溶酶體融合或內(nèi)容物降解)損傷產(chǎn)生[30]，因此共同研究LC3與組成自噬體的其他成分 (如自噬相關(guān)蛋白Beclin-1) 以及自噬溶酶體底物(P62)是更可取的研究方法。自噬誘導(dǎo)后，Beclin-l從Bcl-2上分離，與Vps34、Vps15、自噬相關(guān)蛋白和紫外線輻射抵抗相關(guān)基因(UV radiation resistance associated gene, UVRAG)組成復(fù)合物，招募其他的Atg組成前自噬體結(jié)構(gòu)，促進(jìn)自噬體的形成以及成熟[31]，因此調(diào)節(jié)蛋白Beclin-l表達(dá)增加同樣也表示自噬功能增強(qiáng)[32]。P62是一種自噬底物蛋白，P62和與其結(jié)合的多聚泛素化蛋白被完整的自噬小體吞噬，隨著自噬小體在溶酶體中降解而被消除，細(xì)胞內(nèi)P62的堆積表明細(xì)胞自噬功能受損[33]。

本研究結(jié)果提示，與正常組大鼠相比，DA組大鼠無神經(jīng)病理性疼痛形成，但脊髓LC3-II水平升高，而Beclin-1和P62無明顯改變，提示糖尿病無神經(jīng)病理性疼痛大鼠的自噬水平只停留在自噬體形成的早期階段，并無后續(xù)的自噬體成熟、降解底物的過程。與正常組大鼠相比，DNP組大鼠MWT降低、TWL縮短，大鼠脊髓LC3-II和Beclin-1蛋白質(zhì)表達(dá)增加，P62表達(dá)減少，提示2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓自噬功能增強(qiáng)。DNP組大鼠的LC3-II水平高于DA組，表明糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠的自噬水平高于糖尿病無神經(jīng)病理性疼痛大鼠。P62的免疫熒光雙染色結(jié)果提示，2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓自噬功能活化主要發(fā)生在脊髓背角神經(jīng)元中，少部分出現(xiàn)在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，提示脊髓背角神經(jīng)元的自噬水平在2型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，少部分出現(xiàn)在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的自噬激活可能與炎癥有關(guān)[34]。有研究提示，GABA能抑制性神經(jīng)元自噬水平過度激活可誘導(dǎo)細(xì)胞2型程序型死亡，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的丟失，在大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用，使用自噬抑制劑三甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)能顯著緩解這種疼痛[35]。本研究表明，脊髓背角神經(jīng)元自噬功能的激活主要參與2型DNP，但GABA能抑制性神經(jīng)元是否參與其中尚待進(jìn)一步研究。