楊張良， 徐慧琳， 程 茵， 趙金幗， 周宇杰， 翁楊菁， 王旭燾， 齊敏友

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院藥理研究所， 杭州 310014)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥之一，也是糖尿病致死、致殘的主要原因之一，炎癥反應(yīng)在糖尿病心肌病發(fā)病中起了關(guān)鍵作用[1-2]。NOD樣受體蛋白3 (NOD-like receptor protein 3, NLRP3)炎癥小體是一種調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)的復(fù)合蛋白，其激活可上調(diào)下游促炎細(xì)胞因子白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)的表達(dá)，與糖尿病及糖尿病并發(fā)癥的進(jìn)展關(guān)系密切[3]。Luo等[4]研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體在2型糖尿病大鼠心肌組織中表達(dá)顯著升高，沉默NLRP3基因可以改善糖尿病大鼠心肌病。熊果酸(ursolic acid, UA)廣泛存在于女貞、夏枯草等天然植物中，具有抗腫瘤、抗炎等藥理活性[5-6]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)報(bào)道，熊果酸通過降血糖、抗氧化和抑制心肌組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)生成，改善糖尿病小鼠心肌纖維化[7]。但熊果酸能否抑制心肌組織NLRP3炎癥小體表達(dá)，進(jìn)而對(duì)心臟起保護(hù)作用，鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠模型，觀察熊果酸改善心肌組織病變的作用及其機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

鏈脲佐菌素(HPLC≥98%，美國(guó)Sigma公司)；熊果酸(HPLC≥98%，西安開來公司)；血糖儀、血糖試紙(Onetouchultraeasy，美國(guó)Johnson公司)；肌酸激酶、乳酸脫氫酶、超氧化物歧化酶、丙二醛試劑盒(南京建成研究所)；兔抗小鼠NLRP3抗體、兔抗小鼠IL-1β抗體(武漢博士德公司)。超低溫冰箱(702，美國(guó)Thermo公司)；電子天平(AL104，瑞士Mettler Toledo公司)；超純水儀(PureLab Classical，英國(guó)ELGA)；均質(zhì)分散機(jī)(D-160，北京大龍公司)；大容量高速冷凍離心機(jī) (Z36HK，德國(guó)Hermle公司)；恒溫水浴箱(WB22LA，德國(guó)Memmert公司)；多功能酶標(biāo)儀(Synergy H1，美國(guó)Bio Tek公司)；倒置熒光顯微鏡(TI-S，日本Nikon公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和模型建立

健康雄性ICR小鼠30只，SPF級(jí)，(20±2) g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。30只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10)和造模組(n=20)。對(duì)照組和造模組分別以常規(guī)飲食及高脂飲食飼養(yǎng)，連續(xù)6周。將STZ溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。造模組小鼠腹腔注射STZ(30 mg/kg)，對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，連續(xù)5 d，每日一次。9 d后測(cè)定空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)，超過11.1 mmol/L視為糖尿病模型。造模組20只糖尿病小鼠隨機(jī)分為模型組和熊果酸組(n=10)。第7-16周，對(duì)照組給予普通飼料，模型組和熊果酸組給予高脂飼料，熊果酸研磨成粉，用生理鹽水制成混懸液，超聲混勻。熊果酸組小鼠灌胃熊果酸(100 mg/kg)，正常組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)8周。

1.3 一般指標(biāo)檢測(cè)

小鼠末次給藥后，禁食不禁水12 h，稱體重并測(cè)定空腹血糖。

1.4 樣本收集

血樣本留?。盒∈笳矍蛉⊙?，常溫靜置6 h，離心取上清，-20℃冰箱保存待用。心臟質(zhì)量指數(shù)(heart mass index, HMI)和左室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index, LVMI)測(cè)定：處死小鼠，迅速摘取心臟，擠出心腔血液，剪除心耳、血管及心包膜，用生理鹽水洗凈后稱取心重；剪除心房及右心室，稱取左心室重；HMI =心重(mg)/體重(g)；LVMI =左心室重(mg)/心重(mg)。心肌組織樣本留?。喝∵m量心肌組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，其余左心室心肌組織置-80℃超低溫冰箱保存待用。

1.5 生化指標(biāo)檢測(cè)

按試劑盒說明書測(cè)定血清肌酸激酶(creatine kinase, CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性；心肌組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。

1.6 病理學(xué)檢測(cè)

心肌組織置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h后，將左心室沿縱軸切成約2 mm的片，脫水，透明，石蠟包埋后保存。臨用時(shí)，將蠟塊切成4 μm厚片，65℃烤片1 h，二甲苯脫蠟，無水乙醇梯度水化，蘇木素液染色和伊紅染色，無水乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。400倍光鏡下觀察心肌細(xì)胞病理改變并拍照。

1.7 免疫組化檢測(cè)NLRP3、IL-1β蛋白質(zhì)表達(dá)

將蠟塊切成4 μm厚片，切片加熱，脫蠟至水；10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液煮沸2 min，3% H2O2處理10 min進(jìn)行抗原熱修復(fù)。使用山羊血清封閉后，加入兔抗小鼠NLRP3、IL-1β多克隆抗體(1∶100)4℃過夜，PBS清洗；加入生物素標(biāo)記的二抗，孵育20 min，PBS清洗；滴加Envision工作液，孵育20 min；滴加DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色程度后水洗；蘇木素輕度復(fù)染，脫水，二甲苯透明，樹膠封片。

于400倍光鏡下，每組選取6個(gè)視野進(jìn)行觀察、拍攝；采用Image Pro Plus 6.0軟件分析，計(jì)算每張圖片的吸光度=積分吸光度/面積，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 熊果酸對(duì)小鼠一般體征、體重和血糖的影響

對(duì)照組小鼠精神良好，毛色潔白，飲食、攝水正常，體重逐步增加。模型組小鼠精神萎靡，毛色深黃，多飲、多食、多尿；與對(duì)照組比較，體重顯著降低、空腹血糖顯著升高(P<0.01，表1)。熊果酸組小鼠精神較好，毛色較亮，三多一少癥狀較模型組明顯改善；與模型組比較，熊果酸組小鼠體重有增加趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，血糖顯著降低(P<0.01，表1)。提示熊果酸能有效降低糖尿病小鼠血糖水平。

Tab. 1 Changes of body weight and fasting blood glucose in mice before and after ursolic acid administration ±s, n=10)

BW: Body weight; FBG: Fasting blood glucose; UA: Ursolic acid

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

2.2 熊果酸對(duì)HWI、LVMI的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)和左室質(zhì)量指數(shù)增大(P<0.01)；與模型組相比，熊果酸組小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)和左室質(zhì)量指數(shù)減小(P<0.01,P<0.05，表2)。提示熊果酸能有效改善糖尿病小鼠心臟肥大和左室肥厚。

GroupHMI (mg/g)LVMI (mg/mg)Control3.15±0.240.58±0.05Model4.19±0.55**0.69±0.07**UA3.64±0.28##0.62±0.02#

HMI: Heart mass index; LVMI: Left ventricular mass index; UA: Ursolic acid

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

2.3 熊果酸對(duì)血清CK、LDH活性和心肌SOD活性、MDA含量的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清CK、LDH水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，熊果酸組小鼠血清CK、LDH水平顯著降低(P<0.01，表3)。提示熊果酸具有減輕糖尿病小鼠心肌組織損傷的作用。

與對(duì)照組相比，模型組小鼠心肌組織SOD活力明顯降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，熊果酸組小鼠SOD活力明顯升高(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.05，表3)。提示熊果酸能明顯提高糖尿病小鼠心肌組織的抗氧化能力。

GroupCK (U/ml)LDH (U/L)SOD (U/mg prot)MDA (nmol/mg prot)Control0.44±0.1112122±1977110.1±18.52.9±0.8Model2.19±0.35**19474±3649**84.5±10.9*5.7±1.4**UA1.04±0.22##14648±1626#122.9±14.1##3.8±0.7#

CK: Creatine kinase; LDH: Lactate dehydrogenase; SOD: Superoxide dismutase; MDA: Malondialdehyde; UA: Ursolic acid

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

2.4 熊果酸對(duì)心肌組織形態(tài)學(xué)的影響

HE染色顯示：對(duì)照組小鼠心肌纖維排列整齊，橫紋清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核分布于細(xì)胞中央且大小均一，細(xì)胞間隙正常，間質(zhì)未見炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠心肌纖維排列紊亂，細(xì)胞水腫、肥大，可見局灶性壞死、細(xì)胞間質(zhì)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。熊果酸組小鼠心肌纖維排列較整齊，細(xì)胞肥大明顯好轉(zhuǎn)，間質(zhì)炎細(xì)胞僅少量存在(圖1，箭頭表示炎性細(xì)胞)。

2.5 熊果酸對(duì)心肌組織NLRP3、IL-1β表達(dá)的影響

如圖2、3(箭頭表示NLRP3、IL-1β蛋白)和表4所示，在免疫組化實(shí)驗(yàn)中，NLRP3、IL-1β主要表達(dá)于心肌細(xì)胞漿中。對(duì)照組小鼠僅有少量NLRP3、IL-1β表達(dá)；與對(duì)照組相比，模型組小鼠NLRP3、IL-1β表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，熊果酸組小鼠NLRP3、IL-1β表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。

Fig.1Effects of ursolic acid on pathological changes in myocardium of diabetic mice (HE ×200)

A: Control group; B: Model group; C: UA group; UA: Ursolic acid

GroupNLRP3IL-1βControl0.0732±0.01760.0653±0.0284Model0.2125±0.0137**0.1978±0.0247**UA0.1439±0.0129##0.1019±0.0170##

NLRP3: NOD-like receptor protein 3; IL-1β: Interleukin-1β; UA: Ursolic acid

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

Fig.2Expression of NLRP3 in the myocardium tissue of mice (×400)

A: Control group; B: Model group; C: UA group; UA: Ursolic acid

Fig.3Expression of IL-1β in the myocardium tissue of mice (×400)

A: Control group; B: Model group; C: UA group; UA: Ursolic acid

3 討論

DCM是一種獨(dú)立于高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化及其他心臟病變的特異性心肌病，低度慢性炎癥反應(yīng)與DCM關(guān)系密切[8]。本實(shí)驗(yàn)通過高脂飲食結(jié)合小劑量STZ制備糖尿病小鼠模型。模型小鼠空腹血糖中等程度升高，表現(xiàn)出多飲、多食、多尿和體重減輕癥狀，心臟質(zhì)量指數(shù)、左室質(zhì)量指數(shù)增大，血清CK、LDH活性顯著升高，說明造模成功。HE染色顯示：心肌纖維排列紊亂、細(xì)胞肥大、間質(zhì)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，符合DCM病理特征。給予熊果酸治療8周后，上述各項(xiàng)指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)，心肌組織NLRP3炎癥小體和IL-1β表達(dá)顯著下調(diào)，說明熊果酸能減輕心肌炎癥反應(yīng)，從而對(duì)心肌組織起到保護(hù)作用。

NLRP3炎癥小體是由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)、前體天冬半胱氨酸酶-1(pro-caspase-1)組成的蛋白復(fù)合體，是固有免疫的重要組成部分[3]。研究報(bào)道，高糖環(huán)境下，受損的線粒體釋放大量活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)，機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)；過度增加的ROS可以激活NLRP3炎癥小體，引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致下游促炎細(xì)胞因子IL-1β剪切成熟和分泌，引起組織炎癥反應(yīng)[3]。因此，抑制NLRP3炎癥小體激活是減輕炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵。

熊果酸是一種五環(huán)三萜類化合物，其抗炎作用被多次報(bào)道。Lu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸可減輕D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠大腦炎癥反應(yīng)；Leng等[10]實(shí)驗(yàn)表明，熊果酸通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬，抑制IL-1β分泌，減輕炎癥反應(yīng)，改善小鼠動(dòng)脈粥樣硬化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病小鼠經(jīng)熊果酸干預(yù)后，心肌組織NLRP3和IL-1β蛋白質(zhì)表達(dá)顯著減少，表明熊果酸對(duì)心肌組織具有抗炎作用。此外，相較于模型組，熊果酸組小鼠空腹血糖顯著降低，心肌組織MDA含量下降33.3%，SOD活力上升45.4%，表明熊果酸能減輕心肌組織氧化應(yīng)激水平，增加心肌抗氧化能力，這與我們前期報(bào)道的結(jié)果相一致[7]。

綜上所述，熊果酸改善糖尿病心肌病變，其作用機(jī)制可能與控制血糖，減輕心肌組織氧化應(yīng)激損傷、下調(diào)NLRP3炎癥小體和IL-1β的表達(dá)有關(guān)。鑒于臨床對(duì)DCM尚缺乏有效的治療手段和治療方法，闡明熊果酸對(duì)DCM的作用機(jī)制，具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。