關(guān)晶晶， 張 穎， 劉玉潔△

(1. 天津醫(yī)科大學(xué)研究生院， 天津 300070； 2. 天津市胸科醫(yī)院心內(nèi)四科， 天津 300222)

冠脈支架內(nèi)再狹窄(in-stent restenosis，ISR)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)患者支架植入術(shù)后中遠(yuǎn)期最主要的并發(fā)癥之一，也是當(dāng)前經(jīng)皮冠狀動脈介入治療( percutaneous coronary intervention，PCI)領(lǐng)域亟待解決的問題。雖然目前大多使用藥物洗脫支架(drug-eluting stent，DES)，ISR發(fā)生率較金屬裸支架明顯減低，但其發(fā)生率仍在5%～10%[1]。評價ISR的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是冠狀動脈造影(coronary arteriongraphy，CAG)檢查，但其存在有創(chuàng)性及一定的并發(fā)癥。因此，尋找可以預(yù)測支架植入患者預(yù)后，甚至診斷ISR的生化標(biāo)志物具有重要臨床意義。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類由約22個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，通過識別靶基因3’端非編碼區(qū)靶位點，引起靶基因mRNA降解或抑制其翻譯，進而廣泛地負(fù)調(diào)控靶基因表達(dá)[2]。研究表明，miRNA在心血管細(xì)胞的生長發(fā)育、增殖遷移、損傷凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[3]。隨著胰島素及各種降糖藥的廣泛應(yīng)用，糖尿病(diabetes mellitus，DM)合并酮癥酸中毒及感染致死率明顯下降，心血管病已成為威脅DM患者生命最嚴(yán)重的疾病。Maeng等報道，合并DM的CHD患者PCI術(shù)后9個月支架內(nèi)再狹窄率遠(yuǎn)高于非合并DM的CHD患者，同時DM組具有更多的靶血管重建[4]。Jeff等研究表明，miRNA與DM血管缺血/再灌注損傷及血管新生密切相關(guān)，在血管內(nèi)皮修復(fù)中起負(fù)調(diào)節(jié)作用[5]。

近年來，大量研究表明miRNA-1、miRNA-21與心血管疾病密切相關(guān)。研究顯示，miRNA-1在心肌肥大、心肌梗塞、心律失常等心臟病中發(fā)揮重要作用[6]，miRNA-21可促進損傷后新生內(nèi)膜增生，減少梗死面積[7]?，F(xiàn)階段，miRNA-1、miRNA-21與CHD(尤其是CHD合并DM)患者PCI術(shù)后再狹窄相關(guān)性的試驗研究較少見，且由于存在各類混雜因素，其結(jié)論尚不明確。本研究旨在分析對照組及CHD組患者血漿中miRNA-1、miRNA-21的含量差異，以及miRNA-1、miRNA-21對CHD合并DM患者的影響，并分析支架置入術(shù)后ISR患者與NISR患者血漿miRNA-1、miRNA-21含量的差異，進一步探討miRNA-1、miRNA-21預(yù)測CHD患者，尤其是對CHD合并DM患者發(fā)生ISR的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

連續(xù)入選2013年12月～2015年12月來自天津市胸科醫(yī)院行CAG檢查的382例患者(n=382)，將其分為對照組和CHD組。對照組為可疑心絞痛行CAG檢查排除CHD的患者，共195例(n=195)，根據(jù)是否患DM，又將對照組分為正常對照組(n=150)和單純DM組(n=45)。CHD組為既往已行PCI治療并復(fù)查CAG的患者，共187例(n=187)，根據(jù)是否合并DM，又將CHD組分為單純CHD組(n=119)及CHD合并DM組(n=68)；根據(jù)復(fù)查CAG結(jié)果，又將CHD組(n=187)分為ISR組(n=48)及NISR組(n=139)，又根據(jù)是否合并DM，將ISR組分為單純ISR組(n=26)及ISR合并DM組(n=22)。

診斷標(biāo)準(zhǔn) ⑴CHD：CAG證實至少有1支冠脈分支血管直徑狹窄<50%。⑵ISR[8]：CAG證實支架部位管腔狹窄≥50%(包括支架兩端5 mm以內(nèi))，且排除支架內(nèi)血栓和支架斷裂。⑶DM：患者有糖尿病癥狀+隨機血糖≥11.1 mmol/L，或空腹血糖(指至少空腹8 h)≥7.0 mmol/L，或葡萄糖負(fù)荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L。

納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴NISR組均為CAG檢查證實支架內(nèi)通暢患者(支架內(nèi)管腔狹窄為0)；⑵入選患者植入的支架均為DES；⑶ISR組患者均為首診、單處病變，且在PCI術(shù)后1～2年內(nèi)的患者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴2處及2處以上的ISR患者；⑵急性心肌梗死合并支架內(nèi)血栓或支架斷裂的患者；⑶合并心臟瓣膜病、嚴(yán)重心力衰竭、嚴(yán)重心律失常、嚴(yán)重肝腎功能不全、嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病及既往接受心臟外科手術(shù)治療的患者。

1.2 主要試劑及儀器

總RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光實時定量PCR (qRT-PCR) 試劑盒、成熟miRNA序列(ID000200)、miRNA-21序列(ID000397)、miRNA-1序列(ID000416)、熒光探針及外源性cel-miRNA-39、無水乙醇、無RAN酶純水均購自美國ABI。7500型定量PCR儀(美國ABI)、低溫高速離心機(Sigma)。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本收集 入選對象均于空腹?fàn)顟B(tài)抽取外周靜脈血4 ml，置入枸櫞酸鈉抗凝管中，4℃、3 000 r/min離心10 min，吸取上清液于-80℃保存。

1.3.2 樣本處理 提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后運用試劑盒qRT-PCR進行定量檢測，95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、60 s，40個循環(huán)，組內(nèi)重復(fù)3次取平均值。miRNA表達(dá)水平以Ct值表示，采用2-△△Ct法比較miRNA的相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CHD組miRNA-1、miRNA-21表達(dá)水平的變化

結(jié)果顯示：與對照組相比，CHD組miRNA-1、miRNA-21含量均升高(P<0.05，表1)。

GroupnmiRNA-1miRNA-21Control group1950.452±0.1430.469±0.213CHD group1870.507±0.177*0.509±0.165*

CHD: Coronary atherosclerotic heart disease

*P<0.05vscontrol group

2.2 CHD合并DM組miRNA-1、miRNA-21表達(dá)水平的變化

根據(jù)是否患DM，進一步細(xì)分各組(表2)。結(jié)果顯示：與正常對照組相比，單純DM組miRNA-21含量減低(P<0.05)，而miRNA-1含量無明顯變化(P<0.05)；與單純CHD組相比，CHD-DM組miRNA-1、miRNA-21含量均增加(P<0.05)。

GroupnmiRNA-1miRNA-21Normal group1500.458±0.1420.513±0.203Simple-DM group450.432±0.1450.321±0.179*Simple-CHD group1190.492±0.1690.488±0.145CHD-DM group680.533±0.189#0.547±0.190#

Simple-DM: Simple diabetes mellitus; Simple-CHD: Simple coronary atherosclerotic heart disease; CHD-DM: Coronary atherosclerotic heart disease combined with diabetes mellitus

*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vssimple-CHD group

2.3 ISR組與NISR組miRNA-1、miRNA-21表達(dá)水平的比較

結(jié)果顯示：與NISR組相比，ISR組miRNA-1、miRNA-21含量均明顯升高(P<0.05，表3)。根據(jù)是否合并DM，進一步細(xì)分ISR組。結(jié)果顯示：與單純ISR組比較，ISR-DM組miRNA-21含量明顯升高(P<0.05)，而miRNA-1含量則無明顯差異(P<0.05，表4)。

GroupnmiRNA-1miRNA-21NISR group1390.489±0.1740.440±0.101ISR group480.559±0.178*0.711±0.148*

NISR： Non-in-stent restenosis； ISR: In-stent restenosis

*P<0.05vsNISR group

GroupnmiRNA-1miRNA-21Simple-ISR group260.544±0.1460.665±0.153ISR-DM group220.576±0.2130.768±0.119*

Simple-ISR: Simple in-stent restenosis; ISR-DM: In-stent restenosis with diabetes mellitus

*P<0.05vssimple-ISR group

2.4 CHD合并DM患者PCI術(shù)后再狹窄危險因素分析

以CHD為因變量，DM病史、miRNA-1、miRNA-21為自變量進行單因素logistic回歸分析，并將有統(tǒng)計學(xué)意義的變量進行多因素回歸分析。結(jié)果顯示：DM、miRNA-1、miRNA-21是CHD的獨立危險因素(OR=2.123；OR=3.066；OR=1.924，P<0.05，P<0.01，表5、6)。

以ISR為因變量，DM病史、miRNA-1、miRNA-21為自變量進行單因素logistic回歸分析，并將有意義統(tǒng)計量進行多因素回歸分析。結(jié)果顯示：DM病史、miRNA-21是發(fā)生ISR的獨立危險因素(OR=3.091，OR=5.654；P<0.05，P<0.01，表5、6)；同時，在CHD-DM組中，以ISR為因變量，以miRNA-1、miRNA-21為自變量進行單因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示：miRNA-21是CHD合并DM患者PCI術(shù)后再狹窄的獨立危險因素(OR=9.148，P<0.01，表7)。采用ROC曲線評價miRNA-1、miRNA-21對CHD患者及CHD合并DM患者發(fā)生ISR的預(yù)測價值。結(jié)果顯示：miRNA-1、miRNA-21表達(dá)量對CHD患者發(fā)生ISR有較高診斷價值(AUC=0.854，95%CI為0.801-0.907；AUC=0.857，95%CI為0.768-0.947，圖1A、圖1B)；對于CHD合并DM患者，miRNA-21有較高診斷價值(AUC=0.783，95%CI為0.631-0.935，圖2A)，而miRNA-1的診斷價值較低(AUC=0.463，95%CI為0.294-0.632，圖2B)。

Tab.5Single regression analysis of CHD, ISR

IndexβWaldχ2POR95%CIDM1.02019.4600.001*2.7731.762-4.362CHDmiRNA-11.30558.1390.001*3.6892.637-5.159miRNA-210.72031.3300.001*2.0541.596-2.643DM1.39715.4620.001*4.0432.015-8.113ISRmiRNA-10.5386.4230.001*1.7131.101-4.966miRNA-211.84541.0320.001*6.3273.598-11.125

*P<0.05

Tab.6Multiple regression analysis of CHD, ISR

IndexβWaldχ2POR95%CIDM0.7534.9020.0272.1231.090-4.135CHDmiRNA-11.12033.6020.001*3.0662.099-4.478miRNA-210.6559.5620.0021.9241.271-2.914DM1.1294.6170.0323.0911.104-8.653ISRmiRNA-10.0680.2170.6411.0700.850-1.421miRNA-211.73228.6400.001*5.6542.998-10.662

*P<0.05

Tab.7Single regression analysis of ISR in CHD-DM group

IndexβWaldχ2POR95%CImiRNA-10.1707.7130.1911.1800.919-1.529miRNA-214.5169.2870.002*9.1485.010-16.703

*P<0.05

Fig.1The ROC curve of CHD group

A： miRNA-1; B： miRNA-21

Fig.2The ROC curve of CHD-DM group

A： miRNA-1; B： miRNA-21

3 討論

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一組從內(nèi)膜開始，先后在局部發(fā)生脂質(zhì)與復(fù)合糖類積聚、纖維組織增生和鈣質(zhì)沉積形成斑塊，并伴有血管壁中層退變，繼發(fā)斑塊內(nèi)出血、斑塊破裂及局部血栓形成的病變。Zhu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，血漿中miRNA-1可作用于靶基因肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)，上調(diào)MLCK表達(dá)，促使細(xì)胞向心性收縮，增加血管內(nèi)皮通透性，使炎性細(xì)胞、脂質(zhì)成分等易于侵入并沉積于血管內(nèi)皮內(nèi)，進而發(fā)生AS。Xu等[10]將體外合成的miRNA-1導(dǎo)入心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miRNA-1過度表達(dá)可增高心肌細(xì)胞半胱氨酸天冬氨酸酶-3(caspa細(xì)-細(xì)胞等上呈高表達(dá)，并在許多心血管疾病中呈差異性表達(dá)[11]。Jansen等[12]研究發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)適應(yīng)可顯著上調(diào)miRNA-21表達(dá)，并通過下調(diào)其靶基因程序性細(xì)胞死亡因子-4(programmed cell death 4，PDCD4)，抑制PDCD4下游的轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白質(zhì)-1(activated protein-1，AP-1)激活，對抗氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡。本研究檢測外周血血漿miRNA-1、miRNA-21含量發(fā)現(xiàn)，CHD組患者血漿miRNA-1、miRNA-21含量均顯著高于對照組。結(jié)合上述研究，我們推測，miRNA-1表達(dá)增加可促進心肌缺血/再灌注損傷，而機體可通過增加miRNA-21表達(dá)保護缺血/再灌注損傷的心肌。

美國糖尿病學(xué)會(American Diabetes Association，ADA)和心臟病學(xué)會(American Heart Association，AHA)認(rèn)為，DM是CHD的獨立致病因素。Erkan等[13]采用冠狀動脈Gensini評分系統(tǒng)評估冠脈病變的嚴(yán)重程度和范圍，結(jié)果顯示CHD合并DM患者的評分明顯高于非合并DM的CHD患者，其三支冠脈分支的病變率、彌漫性病變率、病死率均高，且預(yù)后差。李雯琦等[14]發(fā)現(xiàn)，DM大鼠心肌組織中miRNA-1含量明顯低于正常對照組，與高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大相關(guān)指標(biāo)呈現(xiàn)同步性變化，且與ANP基因表達(dá)水平呈線性相關(guān)。劉顯慶等[15]觀察了在不同濃度葡萄糖中培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞miRNA-21和 PDCD4 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)高糖可下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中miRNA-21表達(dá)，同時增加PDCD4蛋白質(zhì)表達(dá)，增加心肌或血管平滑肌細(xì)胞中氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡。上述研究均表明，miRNA-1、miRNA-21與DM患者的心血管并發(fā)癥密切相關(guān)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，單純DM組患者血漿miRNA-21含量減低，而單純DM組與CHD-DM組miRNA-1含量無明顯差異，可能與我們檢測的是外周血血漿相關(guān)。

ISR的發(fā)生是個復(fù)雜的病理生理過程，確切機制尚不明確，但歸納起來主要包括內(nèi)皮損傷、血栓形成、內(nèi)膜增生和血管重構(gòu)?；谏鲜鰉iRNA-1、miRNA-21與CHD關(guān)系的研究，我們推測miRNA-1、miRNA-21在ISR中也可能起重要作用。本研究通過對ISR組與NISR組血漿miRNA-1、miRNA-21含量的比較，證實了上述推測，ISR組miRNA-1和miRNA-21含量明顯高于NISR組。

miRNA-1參與ISR發(fā)生的機制可能與誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及作用于靶基因介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞分化、增值等有關(guān)。張成等[16]發(fā)現(xiàn)，將miRNA-1轉(zhuǎn)染到心臟成纖維細(xì)胞，心肌細(xì)胞特異性因子Gata4、Tbx5、Mef-2c表達(dá)明顯增高，證實miRNA-1可誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。此外，miRNA-1還可通過靶基因組蛋白去乙酰化酶(HDAC4)介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞(VSMC)分化及增殖[17]，而心臟成纖維細(xì)胞過度轉(zhuǎn)分化及VSMC過度增殖均可引起血管壁增厚、管腔狹窄，最終導(dǎo)致ISR發(fā)生。但剌梅等[18]通過比較PCI術(shù)后兩組患者血漿miRNA-1含量，發(fā)現(xiàn)：與NISR組比較，ISR組miRNA-1含量降低，與本研究結(jié)果不一致。同時，本研究中合并DM與非合并DM的ISR患者，其miRNA-1含量無明顯差異，而Feng等[19]研究發(fā)現(xiàn)，DM動物通過抑制miRNA-1增加內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)表達(dá)，誘發(fā)心肌細(xì)胞糖超載及內(nèi)皮功能紊亂，最終導(dǎo)致ISR發(fā)生，研究結(jié)果的差異可能與本研究ISR樣本量較小有關(guān)。因此，還需要更大量樣本的研究來探討miRNA-1對CHD(尤其是CHD合并DM)患者發(fā)生ISR的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，單純DM患者miRNA-21表達(dá)量下降，而合并DM的CHD及合并DM的ISR患者血漿miRNA-21含量增加，我們推測miRNA-21對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有雙重作用，一方面，miRNA-21表達(dá)增加可通過PTEN/PI3K-AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抗細(xì)胞凋亡[12]，而miRNA-21表達(dá)減低可增加PDCD4蛋白表達(dá)，增加心肌或血管平滑肌細(xì)胞中氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡[15]；另一方面，miRNA-21通過介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷、增殖及促進VSMC增殖等機制，參與血管壁新生內(nèi)膜形成，最終導(dǎo)致ISR。Ji等[20]的研究證實了這一點，作者發(fā)現(xiàn)采用球囊拉傷大鼠成熟頸動脈，損傷后再狹窄的頸動脈出現(xiàn)明顯內(nèi)膜增生，血漿miRNA-21表達(dá)明顯上調(diào)；而采用基因敲除法可被動減少miRNA-21表達(dá)，損傷部位血管內(nèi)膜增生狀況得到明顯改善。

本研究發(fā)現(xiàn)DM、miRNA-1、miRNA-21可作為CHD患者獨立危險因素；DM、miRNA-21可作為ISR患者獨立危險因素。進一步分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-21是CHD合并DM患者PCI術(shù)后再狹窄的獨立危險因素。ROC曲線分析結(jié)果顯示，miRNA-21和miRNA-1具有較高的敏感性和特異性，檢測血漿miRNA-1、miRNA-21含量對指導(dǎo)治療CHD患者、預(yù)測ISR發(fā)生及觀察PCI術(shù)后療效具有重要意義，其中miRNA-21對CHD合并DM患者具有更大預(yù)測價值。

綜上所述，DM、miRNA-1、miRNA-21與CHD及PCI術(shù)后再狹窄密切相關(guān)，但其作用機制還存在許多爭議。本研究中，miRNA-1在CHD及PCI術(shù)后再狹窄方面的研究與既往結(jié)果有所差異，但本研究有關(guān)miRNA-21在CHD及PCI術(shù)后再狹窄方面的研究與既往的結(jié)果一致。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA-21對CHD合并DM患者發(fā)生ISR具有較高的預(yù)測價值，miRNA-21可能成為CHD合并DM患者ISR診斷的新途徑和治療的新靶點。