田程遠， 嚴 明△， 張 云， 劉珂舟， 郭 淼， 孫永紅， 薛凌云， 祝 磊△， 徐 瑩

(1. 杭州電子科技大學生命信息與儀器工程學院， 浙江 杭州 310018； 2. 紹興文理學院醫(yī)學院基礎醫(yī)學部， 浙江 紹興 312000； 3. 浙江大學生物醫(yī)學工程與儀器科學學院浙江省心腦血管檢測技術與藥效評價重點實驗室， 杭州 310027)

近年來，隨著我國經(jīng)濟粗放式地發(fā)展，化石能源消費增多等原因導致我國大氣環(huán)境污染日趨嚴重，尤其霧霾污染呈迅速上升趨勢，且爆發(fā)范圍廣、持續(xù)時間長，對民眾健康造成了極大威脅[1]。大氣顆粒物 (ambient particulate matter，PM) 是霧霾的主要成分之一。其中，PM2.5是空氣動力學直徑小于2.5μm的大氣細顆粒物，由于其粒徑小、比表面積大，且表面吸附了重金屬、微生物等大量有毒、有害物質，可通過呼吸達到人體呼吸道深部、沉積于肺泡，甚至能穿過氣血屏障進入血液循環(huán)系統(tǒng)，引發(fā)機體多個系統(tǒng)的廣泛性損傷。流行病學資料顯示，PM2.5暴露可誘發(fā)或加重肺部炎癥、哮喘及動脈粥樣硬化等疾病，且暴露量與疾病的發(fā)病率和死亡率密切相關[2,3]。

肺是呼吸系統(tǒng)的主要器官，對PM2.5的致傷作用十分敏感。毒理學研究表明：PM2.5暴露能導致小鼠肺阻力上升等肺功能改變，還能誘發(fā)肺泡塌陷和炎癥反應等肺部損傷[4,5]。盡管上述研究已證實PM2.5對肺的急性毒性作用，但目前尚未完全闡明PM2.5導致肺損傷效應及其致病機制。

氧化應激是機體氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡而導致的機體應激狀態(tài)，其產(chǎn)生的活性氧能引發(fā)脂質過氧化作用，造成線粒體、內質網(wǎng)等細胞器結構和功能異常，并可促發(fā)炎癥反應，最終導致組織損傷。氧化應激及其所致的細胞器功能異常是否參與了PM2.5所致肺損傷目前尚不清楚。另外，不同地區(qū)PM2.5的化學組成差異對肺組織的毒性影響也不同[6]。因此，本研究擬從杭州市中心城區(qū)采集秋冬季節(jié)的PM2.5顆粒物，通過建立氣管滴注模型，探討杭州市中心城區(qū)PM2.5急性染毒對大鼠肺部的損傷作用，主要關注PM2.5所致肺氧化損傷、炎癥反應和對內質網(wǎng)應激的影響。本研究有望為PM2.5暴露所致肺損傷的毒理學效應提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

KC1000型大氣顆粒物采樣器(青島嶗山電子儀器總廠有限公司)，石英纖維濾膜(PALL Life Sciences，美國)，IX70型倒置顯微鏡(Olympus，日本)，電子分析天平(梅特勒-托利多，瑞士)，酶標儀(Molecular Devices，美國)，真空冷凍干燥儀(Labconco，美國)，高速臺式冷凍離心機(Hermle，德國)。電泳儀、轉膜儀及凝膠成像分析系統(tǒng) (Bio-Rad，美國)。

TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒和ECL化學發(fā)光檢測試劑盒 (杭州聯(lián)科生物技術有限公司)，RIPA裂解液 (上海碧云天生物試劑有限公司)，兔抗大鼠GRP78/94抗體、兔抗大鼠CHOP抗體、兔抗大鼠PERK抗體、兔抗大鼠p-PERK抗體、兔抗大鼠eIF2α抗體、兔抗大鼠p-eIF2α抗體、兔抗大鼠IRE1α抗體、兔抗大鼠XBP1抗體和小鼠抗大鼠β-actin抗體(Cell Signaling，美國)，PVDF膜(Millipore，美國)。

1.2 PM2.5顆粒的收集與準備

2015年9月至2016年12月，在杭州市區(qū)采用KC1000型大氣顆粒物采樣器將PM2.5顆粒采集于石英纖維濾膜上。6 d采樣一次，每次采樣持續(xù)24 h，采樣流量為1.05 m3/min。

將載有PM2.5的濾膜剪成1 cm×1 cm大小，浸入超純水中，超聲處理30 min×3次洗脫PM2.5。洗脫液經(jīng)6層紗布過濾并置于-80 ℃低溫冰箱過夜后，冷凍干燥使水分完全蒸發(fā)得到干燥黑色絮狀物。稱重，染毒前以生理鹽水配制成10 mg/ml懸液，超聲振蕩15 min并滅菌后備用。

1.3 實驗動物處理

將24只SPF級雄性SD大鼠(150 g～180 g) (購自浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心，許可證號：SCXK(浙)2014-0001)隨機分為3組：對照組，PM2.5低劑量組和PM2.5高劑量組(n=8)。PM2.5低劑量組 (Low dose PM2.5 group) 和PM2.5高劑量組 (High dose PM2.5 group) 以氣管滴注的方式進行PM2.5染毒，滴注體積為1 ml/kg BW，染毒劑量分別為5 mg/kg BW和25 mg/kg BW，對照組(Control)給予等體積生理鹽水，每周1次，連續(xù)染毒暴露4周。

1.4 HE染色

大鼠用水合氯醛 (300 mg/kg) 麻醉后，腹主動脈放血處死，暴露氣管和肺。剪取部分左肺，經(jīng)4%多聚甲醛固定2 h，流水沖洗過夜，梯度乙醇 (70%，80%，90%，95%和100%) 處理、石蠟包埋并連續(xù)切片，切片厚度為5 μm。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后行HE染色，置IX70顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學改變。

1.5 支氣管肺泡灌洗液的提取

分離出頸部氣管后，將灌洗針頭插入氣管、結扎固定，并以止血鉗夾閉左側主支氣管。用3 ml預冷的PBS灌洗肺部3次，回收量>50%，將收集到的支氣管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid，BALF) 置于4℃冰箱保存[7]。

1.6 總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脫氫酶(LDH)釋放的檢測

BALF經(jīng)1 500 r/min離心10 min后，收集上清液。采用南京建成生物工程研究所試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書測定BALF中總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脫氫酶(LDH)活性。

1.7 ELISA法檢測炎性因子釋放

BALF經(jīng)1 500 r/min離心10 min后，收集上清液。在96孔板中，每孔加入50 μl上清液，嚴格按照TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒操作說明書，檢測BALF中上述炎性因子含量的變化。

1.8 肺組織蛋白質提取及Western blot

大鼠處死操作同1.4。剪取部分未經(jīng)灌洗的左肺，稱重后按每20 mg組織加入200 μl的比例加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心15 min后收集上清液。BCA法檢測各組大鼠總蛋白濃度后，加入上樣緩沖液并煮沸10 min。冷卻后每孔上樣50 μg蛋白質，作總膠濃度12%的SDS-PAGE。電泳后將蛋白質轉移至PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，分別加入兔抗大鼠PERK抗體、兔抗大鼠p-PERK抗體和兔抗大鼠eIF2α抗體，4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗滌3次，加入HRP標記的二抗室溫孵育2 h，TBST清洗3次后加入ECL顯色液；凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各蛋白質表達的變化。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 PM2.5染毒對大鼠肺組織外觀的影響

如圖1所示，空白對照組大鼠肺呈粉紅色，表面光滑，觸之彈性較好；低劑量PM2.5染毒組大鼠肺表面基本光滑，肉眼可見有少量出血；高劑量PM2.5染毒組大鼠肺表面塌陷、多褶皺，彈性差，出血點較多。上述三組大鼠肺外觀的區(qū)別表明： PM2.5染毒能導致大鼠肺產(chǎn)生病變(圖1見彩圖頁Ⅳ)。

2.2 PM2.5染毒對大鼠肺組織形態(tài)學的影響

光鏡下，空白對照組大鼠肺泡結構基本完整，肺泡壁正常，肺泡隔增厚，但肺泡腔內無明顯淋巴細胞浸潤(圖2A)；低劑量和高劑量PM2.5染毒組大鼠肺組織均可見明顯的炎癥改變，表現(xiàn)為部分肺泡萎縮或消失、肺泡壁增厚，肺組織內淋巴細胞數(shù)量增多且浸潤明顯(圖2B，2C，見彩圖頁Ⅳ)。

2.3 PM2.5染毒對大鼠炎性因子表達的影響

與空白對照組比較，低劑量和高劑量PM2.5染毒組大鼠BALF中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著上升，高劑量組上述指標分別升至空白對照組的1.27倍、2.27倍和1.22倍(表1，P<0.05)，提示PM2.5染毒可誘導大鼠肺部的炎癥反應，且低劑量與高劑量PM2.5染毒組大鼠BALF中的TNF-α和IL-1β水平也存在顯著差異(表1，P<0.01)。

GroupTNF-αIL-1βIL-6 Control56.89±4.88144.12±14.1526.94±4.04Low dose PM2.565.50±5.85*267.30±27.10*34.22±4.94*High dose PM2.572.40±6.01**#327.54±40.91*#37.80±5.71*

Control group: Intratracheal instillation of 1 ml/kg BW saline; Low dose PM2.5 group: Intratracheal instillation of 5 mg/kg BW PM2.5; High dose PM2.5 group: Intratracheal instillation of 25 mg/kg BW PM2.5; TNF-α: Tumor necrosis factor-alpha; IL-1β: Interleukin-1 beta; IL-6: Interleukin-6

*P<0.05,##P<0.01vscontrol group;#P<0.05vslow dose PM2.5 group

2.4 PM2.5染毒對大鼠T-AOC含量、SOD和LDH活性的影響

與空白對照組比較，低劑量和高劑量PM2.5染毒組大鼠BALF中T-AOC含量和SOD活性明顯下降，低劑量組大鼠分別降至空白對照組的69.41%和70.83%，高劑量組大鼠分別降至空白對照組的60%和50% (P<0.05，表2)；而低劑量和高劑量PM2.5染毒組大鼠BALF中的LDH活性則呈劑量依賴性上升，其LDH活性分別上升至空白對照組的2.05倍和2.83倍(P<0.05，表2)，且低劑量與高劑量PM2.5染毒組之間也存在顯著差異(P<0.05，表2)。

GroupT-AOC(mmol/ml)LDH(mmol/L)SOD (U/ml) Control1.70±0.14251.00±14.530.24±0.09Low dose PM2.51.18±0.20*516.75±39.24*0.17±0.02*High dose PM2.51.02±0.10*710.88±82.43*#0.12±0.01*

Control group: Intratracheal instillation of 1 ml/kg BW saline; Low dose PM2.5 group: Intratracheal instillation of 5 mg/kg PM2.5 ; High dose PM2.5 group: Intratracheal instillation of 25 mg/kg BW PM2.5; T-AOC: Total antioxidant capacity; SOD: Superoxide dismutase; LDH: Lactic dehydrogenase

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vslow dose PM2.5 group

2.5 PM2.5染毒對大鼠肺組織內質網(wǎng)信號通路活化檢測

Western blot結果顯示，高劑量PM2.5染毒組大鼠肺組織發(fā)生內質網(wǎng)應激反應，其PERK/eIF2α和IRE1α信號通路均被激活。具體表現(xiàn)為與空白對照組比較，高劑量PM2.5組大鼠肺組織中內質網(wǎng)應激通路蛋白GRP78、p-PERK、p-eIF2α和CHOP蛋白質水平均顯著增加，PERK和eIF2α蛋白質水平則幾乎不變(圖3)；同時，高劑量PM2.5染毒組大鼠肺組織中IRE1α和XBP1-S的水平也顯著增加，而XBP1-U的水平則明顯下降(圖3)。

3 討論

流行病學和動物實驗均證實，PM2.5與多種呼吸系統(tǒng)疾病密切相關，且PM2.5引發(fā)呼吸系統(tǒng)損傷的程度隨著地區(qū)和季節(jié)的不同存在很大差別[8]。本研究初步探尋了杭州市中心城區(qū)秋冬季PM2.5急性暴露引起的大鼠肺部損傷特征及可能的調控機制。

一般認為，炎癥反應引起的肺組織損傷是PM2.5引發(fā)肺部疾病的主要原因之一。既往研究表明，PM2.5染毒能誘導大鼠或小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的炎性滲出，肺組織勻漿和BALF中的炎性因子IL-6和TNF-α水平顯著上升[4]。本研究也證實，大鼠經(jīng)PM2.5連續(xù)染毒4周后，其肺組織出現(xiàn)明顯的炎癥改變(圖1，圖2)，其BALF中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著上升(表1)。上述實驗結果證實，杭州市中心城區(qū)的PM2.5暴露能刺激肺部炎癥的發(fā)生，而連續(xù)染毒將進一步造成肺部持續(xù)性的慢性炎癥損傷。另一方面，外源性環(huán)境毒性物質還能打破肺部氧化/抗氧化平衡，使得肺組織內自由基、ROS過度蓄積和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶活性下降，引發(fā)氧化應激[9]。肺部發(fā)生的氧化應激不但可以直接損傷氣道上皮和肺組織[10]，造成肺部細胞膜通透性增加或細胞死亡溶解并大量釋放細胞質酶LDH[11]，還能放大炎癥反應，加劇臟器損傷，形成惡性循環(huán)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5染毒組大鼠BALF中T-AOC含量和SOD活性下降，LDH活性顯著上升(表2)，提示PM2.5造成肺組織顯著的氧化損傷。由此我們推測，PM2.5可能通過氧化應激引發(fā)和放大肺部的炎癥反應。

Fig.3The expression of ER stress pathway proteins in rat lung in different groups

*P<0.05vscontrol group

另有研究證實，氧化應激不但能啟動和加劇炎癥反應，還能造成細胞內生物大分子和細胞器(如內質網(wǎng))的不可逆損傷[13,14]。內質網(wǎng)負責細胞內蛋白質合成、修飾和折疊組裝，是氧化應激的重要靶細胞器：缺氧和自由基侵襲等刺激會導致胞內蛋白質錯誤折疊或未折疊蛋白質蓄積并引發(fā)內質網(wǎng)應激(ER stress，ERS)狀態(tài)[15]。ERS可激活PERK/eIF2α、IRE1α和活化轉錄因子6 (activating transcription factor 6，ATF6) 介導的三條信號通路來啟動未折疊蛋白反應，恢復細胞內穩(wěn)態(tài)[16]。Kim等報道，香煙煙霧主要成分之一的重金屬鎘能誘導內質網(wǎng)功能紊亂并同時激活支氣管上皮細胞內ERS反應和炎癥反應[17]；呼吸道合胞病毒感染也能誘導小鼠肺組織活性氧含量上升、PERK蛋白質磷酸化并激活ATF6，并最終觸發(fā)ERS和炎癥反應[18]。本研究結果表明，PM2.5染毒能上調大鼠肺組織內的ERS標志蛋白GRP78蛋白質水平、激活PERK和IRE1α介導的ERS通路：包括PERK、eIF2-α和IRE1α的磷酸化以及XBP1的剪切(圖3)。上述結果提示，PM2.5等環(huán)境毒性物質在肺部損傷過程中能激活ERS的三條信號通路，其通路應答差異可能是由于毒性物質種類不同而造成的。此外，如果上述環(huán)境毒性物質誘導的ERS持續(xù)時間過長或應激反應過度，還可能與氧化應激、炎癥產(chǎn)生協(xié)同作用，導致細胞死亡[19]；而ERS與氧化應激和炎癥的作用不是單向的，炎癥因子和氧化應激也可進一步激活ERS，造成肺纖維化敏感度上升等更大的肺部損傷[18,20]。因此，對于ERS是否通過與氧化應激、炎癥反應的協(xié)同作用加劇PM2.5所致肺部損傷，尚需進行更深入的探討。

綜上，杭州市中心城區(qū)的PM2.5可引起大鼠肺部持續(xù)的炎癥反應和氧化損傷，并導致肺組織細胞發(fā)生ERS，推進PM2.5所致的肺損傷過程。