牛江濤, 張澤國, 曹 瑞, 司昕蕾, 邊甜甜, 李越峰△

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 2. 甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室， 蘭州 730000)

機(jī)體經(jīng)受異乎尋常的心理及精神創(chuàng)傷后，常伴有延遲性、繼發(fā)性的精神障礙，這類創(chuàng)傷多危及生命，給人類帶來驚恐。醫(yī)學(xué)上將此類病癥定義為創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙，即PTSD(post-traumatic stress disorder)[1]。流行病學(xué)統(tǒng)計表明，PTSD的發(fā)病率在逐漸上升[2-3]。睡眠障礙(somnipathy)指機(jī)體在睡眠-覺醒的過程中出現(xiàn)的一系列功能性障礙，PTSD的嚴(yán)重程度與自身睡眠障礙密切聯(lián)系[4]。短期及長期的PTSD均可引發(fā)抑郁、焦慮等情志類疾病，在給人們帶來痛苦的同時極大地影響生活質(zhì)量[5]。研究發(fā)現(xiàn)，PTSD的發(fā)病機(jī)制可能與海馬區(qū)功能和結(jié)構(gòu)的異常改變相關(guān)[6]?！案问栊?、調(diào)情志”可能在機(jī)體急慢性應(yīng)激障礙中起關(guān)鍵性作用[7]。四逆散是調(diào)肝方藥基礎(chǔ)方[8]。高等動物神經(jīng)系統(tǒng)各種功能的發(fā)揮主要以神經(jīng)電信號的發(fā)放和活動形式為主，而大腦的這種特異神經(jīng)電信號活動是形成不同精神、心理狀態(tài)的主要原因[9]。在體多通道技術(shù)，是一種采用電生理技術(shù)進(jìn)行的細(xì)胞外記錄的先進(jìn)方法，應(yīng)用這一技術(shù)可以同步記錄相應(yīng)腦區(qū)大量的神經(jīng)元生物電活動，通過特征量提取，可分析神經(jīng)元動作電位發(fā)放情況及其在時間和空間上的聯(lián)系[10-11]。由于神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活動的基本表現(xiàn)形式為動作電位[12]，所以本實驗從神經(jīng)電生理角度研究四逆散對創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠海馬CA1/CA3區(qū)神經(jīng)元動作電位的影響，為四逆散干預(yù)PTSD的藥效及機(jī)理研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

本實驗選用甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心提供的健康SD大鼠，雄性，體重(180±20) g，合格證號：SCXK(甘)2015-0002。

1.2 藥品

四逆散(柴胡6 g，白芍9 g，枳實6 g，甘草6 g)，生藥購于惠仁堂蘭州二十一分店，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室王明偉副教授鑒定。鹽酸帕羅西汀片，浙江尖峰藥業(yè)有限公司，批號150104，規(guī)格(每片20 mg)，國藥準(zhǔn)字H20040533。

1.3 儀器

Cerebus多通道數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，美國Blackrock Microsystem Inc； SN-1腦立體定位儀，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；自制的幽閉電擊箱。

1.4 分組與給藥

50只實驗大鼠隨機(jī)分為5組(n=10)：即空白組、生理鹽水組、模型組、四逆散組及帕羅西汀組?？瞻捉M和生理鹽水組正常飼養(yǎng)，其他3組用幽閉電擊法復(fù)制PTSD模型，生理鹽水組每天灌胃給與生理鹽水10 ml/kg，模型組于造模前1 h灌胃生理鹽水10 ml/kg，帕羅西汀組和四逆散組分別于造模前1 h灌胃鹽酸帕羅西汀4.2 mg/kg和四逆散2.41 g/kg進(jìn)行處理，每天1次，連續(xù)7 d，造模和干預(yù)同時進(jìn)行。

1.5 模型復(fù)制

電擊模型是PTSD實驗研究中最常用的動物模型，屬公認(rèn)的模型之一[13]。而用“電擊+幽閉”刺激，可使大鼠活動受限、焦慮不安，電擊時因驚悚而撕咬、慘叫，模擬PTSD的效果較好[14]，且有研究表明[15]短時間(3 d)內(nèi)可制備出行為學(xué)改變比較顯著、記憶力受損嚴(yán)重的PTSD實驗大鼠模型。結(jié)合文獻(xiàn)[16-17]及預(yù)實驗結(jié)果，確定利用幽閉電擊法復(fù)制PTSD模型。先將造模箱清洗干凈，并用75%酒精擦拭祛除箱內(nèi)異味，將箱體置于墊板上方，將造模箱電柵欄連接DC電源，但不通電。利用隨機(jī)數(shù)字表抓取大鼠進(jìn)行電擊。將大鼠放入造模箱內(nèi)，每只造模箱內(nèi)每次僅放入1只大鼠，蓋上蓋板并用重物壓緊，營造黑暗幽閉的禁錮環(huán)境，并防止動物逃逸。接通電源，調(diào)整至電壓60 V、電流8 mA，對大鼠足底施以不可逃避的電刺激，每次電刺激10 s后關(guān)閉電源，刺激時間間隔隨機(jī)，總計30次。從造模箱中取出大鼠，依據(jù)組別放回籠中飼養(yǎng)，記錄造模時間。每天早、晚各電擊一次，每日的兩次電擊間隔4～8 h。

1.6 微電極陣列檢測及方法

使用10%水合氯醛麻醉大鼠后，將其固定在腦立體定位儀上，充分暴露顱骨。參考《大鼠腦立體定位圖譜》，在SD大鼠頭顱人字縫兩側(cè)標(biāo)記海馬CA1區(qū)(Bregma P:3.3，L:2.0，H:2.5 mm)，CA3區(qū)(Bregma P:3.3，L:2.5，H:4.0 mm)；用小型電鉆鉆開顱骨充分暴露硬腦膜，用鑷子剝開硬腦膜，以16通道鎳鉻合金微絲電極迅速刺破軟腦膜，緩慢進(jìn)入海馬CA1和CA3區(qū)，深度3.0 mm～4.0 mm。打開記錄系統(tǒng)，待較多通道出現(xiàn)神經(jīng)元放電、動作電位豐富且穩(wěn)定后，記錄180 s動作電位實時數(shù)據(jù)[18]。用NeuroExplorer分析采集的數(shù)據(jù)。

1.7 ISI時間序列采集方法

峰電位區(qū)間(interspike interval，ISI)是相鄰兩次動作電位波峰出現(xiàn)的周期時間。用Neuro Explorer分析軟件導(dǎo)出大鼠海馬區(qū)動作電位發(fā)放脈沖間隔數(shù)據(jù)，獲得大鼠海馬180 s內(nèi)動作電位的峰—峰間期散點圖。該圖以時間離散點為橫坐標(biāo)，以神經(jīng)元發(fā)放動作電位的脈沖間隔(即峰—峰間期)為縱坐標(biāo)，圖中每個點代表相應(yīng)時間點發(fā)放動作電位的脈沖間隔[19]。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬CA1區(qū)峰峰間期隨時間的變化

由圖1、2可知，空白組動作電位間隔序列在0.0～0.3 s為主要區(qū)間，動作電位發(fā)放多為發(fā)散狀，且脈沖較密集。

Fig.1Blank group

Fig.2Saline group

由圖3可知，模型組動作電位間隔序列在0.0～3.0 s為主要區(qū)間，動作電位發(fā)放脈沖較稀少，呈簇狀。

由圖4、5可知，帕羅西汀組、四逆散組動作電位間隔序列在0.0～1.0 s為主要區(qū)間，動作電位發(fā)放脈沖稀少，呈發(fā)散狀。

Fig.3Model group

Fig.4Paroxetine group

Fig.5Sinisan group

2.2 各組大鼠海馬CA3區(qū)峰峰間期隨時間的變化

由圖6、7可知，空白組動作電位間隔序列以0.0～0.3 s為主要區(qū)間，動作電位發(fā)放脈沖密集，呈發(fā)散狀。

由圖8可知，模型組動作電位間隔序列以0.0～3.0 s為主要區(qū)間，動作電位發(fā)放脈沖稀少，呈發(fā)散狀。

Fig.6Blank group

Fig.7Saline group

Fig.8Model group

由圖9、10可知，帕羅西汀組、四逆散組動作電位間隔序列以0.0～1.0s為主要區(qū)間，動作電位發(fā)放脈沖稀少，呈發(fā)散狀。

Fig.9Paroxetine group

Fig.10Sinisan group

2.3 各組大鼠海馬CA1/CA3區(qū)平均峰電位發(fā)放速率

通過圖1～11和表1對大鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元峰電位發(fā)放情況的研究可知：與空白組相比，生理鹽水組大鼠海馬區(qū)單位時間峰電位發(fā)放速率無顯著變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示灌胃刺激不會對大鼠海馬腦區(qū)神經(jīng)元峰電位發(fā)放產(chǎn)生影響。與生理鹽水組比較，模型組大鼠海馬區(qū)單位時間峰電位發(fā)放速率明顯降低(P<0.01)，提示PTSD模型復(fù)制條件的施加可明顯抑制大鼠海馬區(qū)單位時間峰電位發(fā)放。與模型組比較，帕羅西汀、四逆散兩組大鼠海馬區(qū)單位時間峰電位發(fā)放速率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示四逆散以及帕羅西汀可明顯促進(jìn)PTSD大鼠海馬區(qū)單位時間峰電位發(fā)放。與帕羅西汀組比較，四逆散組大鼠海馬區(qū)單位時間峰電位發(fā)放率無顯著性變化(P>0.05)。

GroupHippocampal CA1 area(times/s)Hippocampal CA3 area(times/s)Blank6.54±2.787.00±2.90Saline5.58±2.245.89±2.44Model1.24±0.57**1.36±0.52**Paroxetine4.23±1.42##5.17±2.38##Sinisan5.61±2.52##4.88±2.67##

**P<0.01vssaline group;##P<0.01vsmodel group

**P<0.01vssaline group;##P<0.01vsmodel group

3 討論

動作電位發(fā)放的脈沖間隔(峰—峰間期)是神經(jīng)元信號編碼的重要表達(dá)形式之一[20]。峰—峰間期散點圖可直觀反映動作電位間隔序列隨時間變化的分布特征，從而分析神經(jīng)元動作電位發(fā)放模式隨時間的變化規(guī)律。由上述結(jié)果可見，與空白組比較，生理鹽水組大鼠海馬CA1/CA3區(qū)單位時間峰電位發(fā)放率無明顯變化，提示灌胃刺激對大鼠模型影響不明顯。與生理鹽水組比較，模型組大鼠海馬CA1/CA3區(qū)平均峰電位發(fā)放速率明顯降低，提示幽閉電擊對大鼠海馬區(qū)單位時間平均峰電位發(fā)放速率的抑制作用明顯。與模型組相比，四逆散組、帕羅西汀組大鼠海馬CA1/CA3區(qū)單位時間平均峰電位發(fā)放速率顯著升高，提示帕羅西汀、四逆散均對PTSD及睡眠障礙有明顯的正向調(diào)節(jié)作用。以上結(jié)果提示，幽閉電擊刺激對大鼠海馬CA1/CA3區(qū)峰電位發(fā)放速率有明顯的抑制作用，嚴(yán)重影響海馬區(qū)神經(jīng)元放電活動，而帕羅西汀、四逆散可明顯改善PTSD大鼠海馬CA1/CA3區(qū)神經(jīng)元放電活動。

神經(jīng)信息的傳遞主要由神經(jīng)元通過動作電位的傳導(dǎo)而實現(xiàn)，動作電位內(nèi)含有豐富的神經(jīng)信號。因此，基于神經(jīng)信號的動態(tài)分析可作為探究腦功能穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)。機(jī)體在應(yīng)對強(qiáng)烈的應(yīng)激損害后，中樞神經(jīng)的可塑性變化明顯,特別是海馬、杏仁核、中縫核等處出現(xiàn)神經(jīng)可塑性的異常改變[21]。實驗組透射電鏡實驗觀察的結(jié)果也表明，PTSD及睡眠障礙大鼠海馬CA1/CA3區(qū)神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了異常改變。ISI時間序列說明神經(jīng)元脈沖的時間間隔。研究發(fā)現(xiàn)，電刺激后大鼠海馬CA1/CA3區(qū)神經(jīng)元發(fā)放脈沖間隔明顯延長，且峰電位發(fā)放率也顯著降低，提示電擊刺激抑制了大鼠海馬CA1/CA3區(qū)神經(jīng)元脈沖的發(fā)放，且延長了時間間隔，模型組大鼠海馬CA1/CA3區(qū)神經(jīng)元動作電位發(fā)放頻率的顯著性降低，可作為病變的一種在體的特征性改變。而四逆散及帕羅西汀能縮短脈沖發(fā)放時間，對PTSD大鼠海馬CA1/CA3區(qū)神經(jīng)元動作電位的發(fā)放有明顯的改善作用。