陳 靜 張 磊 盧浩然 從軍灝 商子昂 廖承紅 韓 謙

(海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南?？?570228)

昆蟲表皮由蠟質(zhì)層和幾丁質(zhì)層組成，具有抵御病原體入侵和不利環(huán)境傷害，支持和維持身體活動(dòng)的重要作用。研究表皮合成機(jī)制，尋找干擾昆蟲表皮合成的方法，可用于控制害蟲 (Charles, 2010)。迄今為止，表皮蛋白(cuticular protein, CP)被分為13個(gè)不同的蛋白家族(Willis, 2010; Ioannidouetal., 2014; Liaoetal., 2017)。最大的家族是CPR家族，包含RR氨基酸序列，CPR家族可分成3個(gè)亞族，RR-1、RR-2和RR-3(Andersen, 1998, 2000; Karouzouetal., 2007)。普遍把RR-1型的CPR歸類于柔性表皮。但也有例外，發(fā)現(xiàn)RR-1基序在昆蟲表皮中參與成蟲蛻變時(shí)剛性表皮的分化(Soaresetal., 2007)。RR-2基序蛋白主要分布在硬表皮(Vanninietal., 2017)，RR-3比較少見，目前還沒有精確的定義(Andersen, 2000; Futahashietal., 2008; Willis, 2010)。埃及伊蚊Aedesaegypti是一種廣泛分布于全球熱帶地區(qū)的重要媒介蚊蟲，傳播登革熱和城市型黃熱病等疾病，是國(guó)際公認(rèn)最危險(xiǎn)的蚊蟲之一。對(duì)埃及伊蚊表皮蛋白的研究，不僅可揭示其表皮發(fā)育和形成機(jī)制，還能為傳染病防治提供理論指導(dǎo)。

本研究擬對(duì)埃及伊蚊表皮發(fā)育過程差異基因AaCPR100A(AAEL003049)進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式分析，旨在為深入研究該基因在表皮形成過程中的功能及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蚊蟲

埃及伊蚊Ae.aegypti(利物浦株系)由軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所提供，飼養(yǎng)條件為: 室溫 26 ℃±1 ℃、相對(duì)濕度 60%±5%、光周期為14 L∶ 10 D (光照: 黑暗)。幼蟲以老鼠飼料飼養(yǎng)，成蟲以8% 糖水飼養(yǎng)。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用BLAST對(duì)AaCPR100A氨基酸序列進(jìn)行序列分析，構(gòu)建該蛋白與其他昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并分析其同源性(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。在線分析AaCPR100A的分子量、氨基酸組成(ExPASy，http://us.expasy.org)和信號(hào)肽位點(diǎn)(SignalP4.0，http://www.cbs.dtu.dk)(Bendtsenetal., 2004)。運(yùn)用ScanProsite(http://prosite.expasy.org)(de Castroetal., 2006)分析該蛋白基序。在埃及伊蚊基因組上進(jìn)行blast(http://www.vectorbase.org)分析，確定該基因的內(nèi)含子和外顯子。采用ClustalX(vesion 1.83)(Thompsonetal., 2002)軟件與岡比亞按蚊Anophelesgambiae、白紋伊蚊Ae.albopictus、致倦庫蚊Culexquinquefasciatus和果蠅Drosophilamelanogaster的基因序列進(jìn)行比對(duì)，MAGA6.0軟件(Tamuraetal., 2013)的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

蚊蟲所有齡期樣品為4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)的樣品數(shù)目為：卵20只，1齡幼蟲20只，2齡幼蟲20只，3齡幼蟲10只，4齡幼蟲10只，蛹期5只，雄蟲5只和雌蟲5只。解剖雌性成蟲獲得的頭、胸、中腸和表皮為4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)的樣品數(shù)目為10只。

采用磁珠法提取RNA，所用的磁珠通過0.1%的DEPC水溶液處理過夜后用滅菌鍋消毒。取埃及伊蚊的4個(gè)發(fā)育時(shí)期(成蟲、蛹、幼蟲、卵)和4個(gè)不同組織(頭、胸、中腸、皮)樣品，分別加入200 μL的Trizol裂解液(InvitrogenTM)和適量的磁珠，放入研磨器中打磨4 min，使細(xì)胞充分裂解，提取樣品的總RNA；為了避免基因組DNA對(duì)定量結(jié)果的影響，利用TakaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行去基因組DNA的處理，并進(jìn)行總RNA反轉(zhuǎn)錄。

1.4 熒光定量PCR檢測(cè)不同發(fā)育階段和組織中的表達(dá)量

以埃及伊蚊的3-磷酸脫氫酶基因GAPDH(XM_011494724)為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR檢測(cè)AaCPR100A基因在不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的表達(dá)特征。根據(jù)AaCPR100A和GAPDH序列自行設(shè)計(jì)定量引物，見表1。

表1 引物序列

熒光定量PCR反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL；2×SYBR premix Ex TaqTM10 μL；PCR forward/Reverse primer(10 μmol/L)各0.4 μL；DEPC水6.8 μL。使用Roche公司的LightCycler96進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增檢測(cè)。反應(yīng)采用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：95 ℃ 20 s；95℃5 s；58 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。

根據(jù)各組擴(kuò)增的CT值，采用定量PCR儀數(shù)據(jù)處理程序，以2- △△ Ct法(Livaketal., 2001)分析基因表達(dá)水平計(jì)算樣品間基因表達(dá)量的差異倍數(shù)，根據(jù)數(shù)據(jù)做柱形圖。采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件方差分析(ANOVA)(Tamuraetal., 2013)進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)，采用 LSD 法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水平P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 埃及伊蚊AaCPR100A的序列特征和同源性分析

根據(jù)埃及伊蚊AaCPR100A的cDNA序列在埃及伊蚊基因組上的信息，克隆得到該基因的開放閱讀框，其cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)765 bp，編碼254個(gè)氨基酸，推測(cè)其蛋白分子量為28.6 kDa。氨基酸分析結(jié)果顯示AaCPR100A蛋白含有19種不同的氨基酸組成，其中谷氨酰胺占15.4%、脯氨酸占11.4%，丙氨酸11%。蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明，進(jìn)行Blastp檢索和ScanProsite工具檢索，AaCPR100A有一個(gè)Chitin-binding type R&R domain，位于蛋白的40～101位氨基酸(圖1)。N末端具有信號(hào)肽，約為16個(gè)氨基酸。

圖1 AaCPR100A的蛋白結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Protein domain analysis of AaCPR100A in Aedes aegypti

將AaCPR100A的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)與白紋伊蚊、淡色庫蚊、岡比亞按蚊和果蠅的相似性分別為95%、72%、61%、54%。采用Clustal進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果顯示保守區(qū)段主要集中在Chitin-binding type R&R結(jié)構(gòu)域。利用clustal1.81 軟件和MEGA7.0.26 軟件以NJ法生成系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行Bootstrap 檢測(cè)。結(jié)果顯示，在分析的所有序列中，AaCPR100A與白紋伊蚊的進(jìn)化地位最接近(圖2)。

圖2 AaCPR100A與其他物種的CPR100A氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of Aedes aegypti and other species based on the amino acid sequences of their AaCPR100A

2.2 AaCPR100A基因的組織表達(dá)特性

以3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，分別對(duì)埃及伊蚊頭、胸、中腸和表皮以及不同發(fā)育階段的表達(dá)水平進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。組織定量結(jié)果表明AaCPR100A在4種組織中均有表達(dá)，但相比頭部，在表皮中的表達(dá)豐度值達(dá)到42倍，其次在中腸中表達(dá)為2倍，腦的最低。由此可見，該基因的表達(dá)具有顯著的組織差異性，在表皮中表達(dá)豐度最高(圖3)。

圖3 成蟲不同組織AaCPR100A的表達(dá)情況分析Fig.3 Expression patterns of AaCPR100A in different tissues of of Aedes aegypti三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)是平均值±SE；柱上標(biāo)有不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。Data are mean±SE; Histograms with different letters indicate significant difference (P<0.05).

在不同發(fā)育階段，AaCPR100A的表達(dá)呈現(xiàn)出顯著差異性(圖4)。隨著發(fā)育階段的推移，該基因的表達(dá)量呈減少趨勢(shì)。卵的表達(dá)量與其他發(fā)育階段具顯著性差異，表達(dá)量最高，從2齡幼蟲開始，與雄性成蚊的表達(dá)量相當(dāng)。而雌性成蚊的略有所增加(圖4)。該結(jié)果說明AaCPR100A的表達(dá)具有明顯的發(fā)育階段特異性，可能對(duì)于蚊蟲早期表皮的形成起到重要的作用，并且可能與雌性成蚊腹部存儲(chǔ)血液相關(guān)。

圖4 AaCPR100A在埃及伊蚊不同齡期的表達(dá)量Fig.4 Expression of AaCPR100A in the different stages of Aedes aegypti數(shù)據(jù)是平均值±SE; 柱上標(biāo)有不同字母表示顯著性差異(P<0.05)Data are mean±SE; Histograms with different letters indicate significant difference (P<0.05).

3 討論

昆蟲表皮是昆蟲抵御外界不良環(huán)境的第一道防線，獨(dú)特的表皮是各種昆蟲能成功生存于生物圈中的重要機(jī)理之一，不同的發(fā)育階段均會(huì)產(chǎn)生新的表皮，且以不同的形式分布在昆蟲身體內(nèi)外，從本質(zhì)上確保了昆蟲的成功進(jìn)化，反之昆蟲表皮的獨(dú)特性也使其成為殺蚊劑和蟲媒控制的靶標(biāo)(Luzetal., 2005)。

同時(shí)，表皮也是蚊蟲抗藥性形成的重要屏障。研究發(fā)現(xiàn)，在抗吡蟲啉殺蟲劑的幼蟲和成蟲中,AaCPR100A基因的表達(dá)均比敏感型蟲體的表達(dá)高，幼蟲比成蟲的表達(dá)更顯著(Riazetal., 2013)?？孤染挣ヮ悮⑾x劑的庫蚊Cx.quinquefasciatus品系表皮中有兩個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，分別屬于RR-2和CPLC類型(Reidetal., 2012)。電鏡掃描結(jié)果顯示不吉按蚊Anophelesfunestus對(duì)卞氯菊酯產(chǎn)生抗性后，表皮增厚，藥物穿透能力明顯減弱，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)抗性雌蚊的表皮厚度比抗性雄蚊表皮厚(Woodetal., 2010)。綜合以上研究，表明昆蟲可能會(huì)通過上調(diào)表皮蛋白基因的表達(dá)來合成更多的表皮蛋白，用以增厚表皮，減少殺蟲劑向體內(nèi)滲透，以提高其抗藥性。對(duì)埃及伊蚊表皮基因的研究，將有助于我們了解這類基因在蚊蟲柔性表皮發(fā)育及在雌性成蚊中的功能，并為其最終應(yīng)用于蚊蟲的生物防控提供了理論根據(jù)。

根據(jù)埃及伊蚊蛋白數(shù)據(jù)庫，已發(fā)現(xiàn)成蚊和蛹的表皮蛋白分別有32和60個(gè)被命名，也有許多蛋白被標(biāo)記為假定的表皮蛋白(Neneetal., 2007)。另外，一些預(yù)測(cè)蛋白被歸類為柔性或剛性表皮蛋白。表皮蛋白和幾丁質(zhì)在不同特性和皮層中分布不同，由于幾丁質(zhì)分子鏈長(zhǎng)和乙?；潭鹊牟町愝^小，因此表皮蛋白基因種類和數(shù)量的變化成為影響表皮結(jié)構(gòu)及其機(jī)械性能的重要因素，表皮蛋白也被認(rèn)為是昆蟲重要的結(jié)構(gòu)蛋白(Andersenetal., 1995; Liaoetal., 2017)。本研究基于前期研究的基礎(chǔ)，對(duì)AaCPR100A基因的序列和時(shí)空表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)該基因在蚊蟲的卵期發(fā)育過程轉(zhuǎn)錄水平明顯高于幼蟲和成蟲期，雌性成蚊高于雄性成蚊，并具有一定的組織特異性，這可能不僅參與了蚊蟲早期表皮結(jié)構(gòu)的形成，而且在雌性成蟲中也發(fā)揮重要作用。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的分析，AaCPR100A具有CPR家族中的RR-1基序，而RR-1亞族表皮蛋白首先是從柔性表皮中分離得到，現(xiàn)在普遍把RR-1型的CPR歸類于柔性表皮。雌性蚊子的腹部往往需要能容納下與其體重等同的血液，因此，形成具有保護(hù)作用的高度彈性的表皮對(duì)它尤其重要。因此，我們推測(cè)AaCPR100A可能參與了蚊蟲柔性表皮的形成，這將在之后的功能研究中進(jìn)一步探討。