王亞萍 陳 鍇 李東琴 田 璞 劉永仙 李寶莉**

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 陜西延安 716000； 2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院, 陜西延安 716000； 3.南昌大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像專業(yè)，江西南昌 330000)

陰道毛滴蟲TrichomonasvaginalisDonne 1837是寄生在人體陰道和泌尿道的鞭毛蟲，主要引起滴蟲性陰道炎和尿道炎，以性傳播為主。目前，WHO推薦的治療陰道毛滴蟲的藥物為甲硝唑，但此類藥物脂溶性較高，且易透過(guò)胎盤和血腦屏障，如果孕婦服用，則可能導(dǎo)致胎兒畸形，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明此藥對(duì)嚙齒類動(dòng)物有致癌作用(WHO, 1996)。由于臨床分離的陰道毛滴蟲因遺傳變異引起耐藥株的出現(xiàn)，進(jìn)而臨床用藥劑量加大，副作用增加(劉建華等，2013；Senaetal., 2014; Hawkinsetal., 2015; Keatingetal., 2015; Maoetal., 2015)。國(guó)內(nèi)研究了較多單劑和復(fù)方中藥制劑對(duì)陰道毛滴蟲的作用，中藥復(fù)方制劑內(nèi)多含黃芩、白頭翁、苦參、黃連、菊花、蛇床子、黃芪、黃柏等，用中藥單劑殺陰道毛滴蟲，存在用藥量大、療程長(zhǎng)、殺蟲效果不及西藥制劑等缺點(diǎn)(白靜等，2014)。此外，Lindmark等(2014)報(bào)道甲硝唑由于能使細(xì)菌突變而對(duì)人有潛在的威脅。因此，尋求高效、低毒、新型的藥物是防治陰道毛滴蟲病的主要研究方向之一。本研究選用中藥坤泰洗劑進(jìn)行體外抗滴蟲作用, 初步探討該藥對(duì)陰道毛滴蟲的殺蟲療效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)蟲株來(lái)源

蟲株取自延安大學(xué)附屬醫(yī)院婦科門診，無(wú)菌環(huán)境下，用棉簽拭子從滴蟲性陰道炎患者陰道后穹窿部位取陰道分泌物，按照張潞渝等(2011)的培養(yǎng)方法，將其接種于含有胎牛血清及青霉素、鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，并置 37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h 后，轉(zhuǎn)種 1 次。收集蟲體，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，待其穩(wěn)定生長(zhǎng)后，吸取少量蟲液涂片，自然干燥后，進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色，光鏡下鏡檢。同時(shí)在無(wú)菌條件下，收集培養(yǎng)液中的蟲體，以2 000×g離心8 min后，去掉2/3上清液，用不含血清的培養(yǎng)液洗滌 2次后收集蟲體、計(jì)數(shù)，制成5×104濃度的蟲液，于 37 ℃水浴箱中，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)計(jì)算蟲體活力(活蟲臺(tái)盼藍(lán)不著色，死蟲體著色呈藍(lán)色)，活蟲占 99%以上，以上操作在25 ℃的室溫下進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

坤泰洗劑由五倍子RhuschinensisMill.、白芷Angelicadahurica、石斛DendrobiumnobileLindl、丁香Syringa Linn、川芎LigusticumchuanxiongHort、當(dāng)歸Angelicasinensis、珍珠Pernulo、紅參Radixginsengrubra等8種中草藥組成，其各成分均購(gòu)自延安大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房。陽(yáng)性藥物甲硝唑?yàn)槠瑒?00 mg/粒，批號(hào) 20020930，湖北華中制藥廠產(chǎn)品。潔爾陰洗液300 mL/瓶, 國(guó)藥準(zhǔn)字Z10930008，四川恩威制藥有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料

RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購(gòu)自杭州四季青有限公司；瑞氏-吉姆薩染色液購(gòu)自武漢博士德生物有限公司；0.4%臺(tái)盼藍(lán)、光學(xué)顯微鏡、無(wú)菌操作臺(tái)、培養(yǎng)箱等均由延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.4 藥液的制備及分組

坤泰洗劑各稱取一定量的中藥藥材, 分別取五倍子30 g、白芷10 g、石斛10 g、丁香10 g、川芎10 g、珍珠40 g、當(dāng)歸10 g、紅參50 g,破碎后除去其雜質(zhì),并沖洗干凈,后干燥、粉碎，經(jīng)40目過(guò)篩,按實(shí)驗(yàn)藥物劑量最優(yōu)組合加80%乙醇，水浴3 h，過(guò)濾，抽離,萃取，計(jì)算得出萃取率為17.27%，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)酒精，烘干，刮取干粉，經(jīng)配比計(jì)算得出原液濃度為4.21 mg/mL，按預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將藥物濃度用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16共5個(gè)濃度組。甲硝唑制成粉末，取0.2 g 加入無(wú)血清1640液 25 mL，制成原濃度為 8 mg/mL，按倍比稀釋為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16。10%潔爾陰洗液原液，同樣用無(wú)血清培養(yǎng)液按照濃度比1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀釋為5組，用移液器將各種藥液加入 24 孔培養(yǎng)板，每孔 3 mL。 本實(shí)驗(yàn)設(shè)坤泰藥物組、甲硝唑組、潔爾陰洗液組及RPMI-1640 培養(yǎng)液組和 80%乙醇浸泡組(取坤泰洗劑混合組稱取5.5 g藥材粉末并加入22.5 mL 80%的乙醇于圓底燒瓶中，浸泡23 d，封口以備用)。

1.5 滴蟲在藥液中的培養(yǎng)

在已配好的藥液中， 分別加入陰道毛滴蟲 5×104個(gè)，將培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2、6、12、24、48 h，后吸取各孔蟲液，滴入計(jì)數(shù)板內(nèi)，高倍顯微鏡下鏡檢,計(jì)算蟲體死亡率。對(duì)死亡率為100%的實(shí)驗(yàn)管進(jìn)行轉(zhuǎn)種，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察是否有滴蟲存活。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 蟲體計(jì)數(shù)過(guò)程

置顯微鏡下數(shù)計(jì)數(shù)板內(nèi)四角大方格內(nèi)的蟲體總數(shù)，只計(jì)對(duì)角線的蟲體，對(duì)于壓線的只計(jì)在上線的和坐線的，若成團(tuán)的蟲體則按單個(gè)蟲體計(jì)算。蟲體數(shù)=(4 大格細(xì)胞總數(shù)÷4)×104(個(gè)/mL)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)藥液對(duì)陰道毛滴蟲的殺蟲效果

1∶1坤泰洗劑作用陰道毛滴蟲2 h 時(shí)，殺蟲率為93.47%。不同濃度組的坤泰洗液作用陰道毛滴蟲24 h 后，均有不同程度抑制作用，1∶2、1∶4、1∶8濃度組作用24 h后殺蟲率都達(dá)到100%，可見坤泰洗劑體外外最低殺蟲稀釋度(minimal lethal concentrations， MLCs)為1∶8。1∶1甲硝唑作用陰道毛滴蟲2 h后，殺蟲率為90.92%，甲硝唑在1∶8、1∶16低濃度組作用24 h后僅有抑制陰道毛滴蟲的作用，而在1∶2、1∶4高濃度組作用 24 h后抗陰道毛滴蟲率為100%，并繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，染色鏡檢活蟲率為0%。故以1∶4稀釋濃度組作為甲硝最低殺蟲稀釋度。潔爾陰洗劑 1∶1 稀釋濃度組2 h時(shí)的殺蟲率為83.45%，稀釋度1∶16作用24 h有不同程度抑制滴蟲生長(zhǎng)的作用，1∶1、1∶2稀釋濃度組在 24 h已全部殺滅陰道毛滴蟲，且48 h后未見陰道毛滴蟲生長(zhǎng)，稀釋濃度 1∶2為潔爾陰洗劑對(duì)陰道毛滴蟲最低抑蟲濃度。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)可以看出，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物的殺蟲效果逐漸增強(qiáng)，對(duì)滴蟲的抑制率隨著藥物濃度的增加而增加。將藥物抗蟲后無(wú)滴蟲生長(zhǎng)的陰性培養(yǎng)液吸出，用不含血清培養(yǎng)液洗滌后，轉(zhuǎn)入含血清的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24后，未見滴蟲生長(zhǎng)。乙醇浸泡組和無(wú)藥對(duì)照組滴蟲生長(zhǎng)良好，24 h滴蟲死亡率小于5%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。

2.2 顯微鏡下形態(tài)

鏡下觀察對(duì)照組陰道毛滴蟲，蟲體圓形或橢圓形，無(wú)色透明,可見鞭毛擺動(dòng)，運(yùn)動(dòng)活躍。經(jīng)瑞氏-吉姆薩染色后,蟲體多呈橢圓形或梨形, 結(jié)構(gòu)完整, 輪廓清晰 (圖1-a)。經(jīng)藥物作用后,其形態(tài)發(fā)生明顯變化。選取坤泰洗劑1∶4作為實(shí)驗(yàn)組作用24 h后觀察,染色后油鏡觀察，其蟲體收縮變圓,部分蟲體裂解、內(nèi)容物外溢、邊緣不整,甚至分解為碎片(圖1-b)。

表1 坤泰洗劑及各藥體外對(duì)陰道毛滴蟲殺蟲效果(n=5)Fig.1 The effect of Kuntai Lotion on the T. vaginalis in vitro

圖1 陰道毛滴蟲形態(tài)觀察Fig.1 Trichomonas vaginalis under microscopesa.瑞氏-吉姆薩染色；b. 坤泰洗液1∶4作用24 h后的滴蟲。a. T. vaginalis stained by Wright-Giemsa staining method；b. Trichomonas vaginalis after treated by Kuntai Lotion 1∶4 for 24 h.

2.3 實(shí)驗(yàn)藥液對(duì)陰道毛滴蟲的殺蟲效果的統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)藥物對(duì)陰道毛滴蟲的殺蟲率，對(duì)表1 中不同處理組的藥物及作用12 h后進(jìn)行方差分析檢驗(yàn)。1∶8濃度組坤泰洗劑對(duì)陰道毛滴蟲的作用與80%乙醇浸泡組在同時(shí)間對(duì)比，P值0.03(P<0.05)；R同時(shí)與RPMI-1640 培養(yǎng)液對(duì)比，P值為0.02(P<0.05)，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)方差分析，1∶8坤泰洗劑同1∶4甲硝唑殺蟲效果相近，P值為0.43(P>0.05)，差異無(wú)顯著性，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與1∶8潔爾陰洗液相比，具有顯著差異性，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，殺蟲效果強(qiáng)于潔爾陰洗液。見表2。

表2 坤泰洗劑對(duì)滴蟲的體外方差分析Tab.2 Analysis of variance to KunTai Lotion on T.vaginalis in vitro

3 討論

據(jù)報(bào)道，治療滴蟲性陰道炎的中藥已有很多種類(陳熙等，2012；Sharafietal., 2013; Ezz Eldinetal., 2015; Kashanetal., 2015; 張廣求, 2016)。 本實(shí)驗(yàn)研究復(fù)合中藥坤泰洗劑對(duì)陰道毛滴蟲的殺蟲作用。本實(shí)驗(yàn)坤泰洗劑是由五倍子、石斛、白芷、丁香、珍珠、川芎、紅參、當(dāng)歸等8味中草藥復(fù)方組成，其中五倍子為主藥，白芷、珍珠粉、川芎、人參等其他藥為配方組成，研究表明五倍子、石斛、白芷、丁香、紅參、當(dāng)歸、珍珠粉、川穹均具有抗菌、抗滴蟲作用(Lindmarketal., 1976; 于慶杰等，2009；楊雅西等，2012)，尤其以五倍子、白芷的功效較為顯著。潘玉華等(2002)對(duì)8種中藥體外抗滴蟲的研究表明五倍子具有顯著的殺蟲作用，丁香具有抑制滴蟲生長(zhǎng)的作用，而珍珠、當(dāng)歸、石斛、人參能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，坤泰洗劑對(duì)陰道毛滴蟲具有顯著的抗蟲效果，在同時(shí)間、相同稀釋濃度，坤泰洗劑殺蟲效果與甲硝唑近似，其體外殺蟲的最低殺蟲濃度1∶8， 坤泰洗劑 1∶1濃度對(duì)陰道毛滴蟲在 2 h殺蟲率93.47%，且隨著藥物濃度的遞增，作用時(shí)間的延長(zhǎng)，24 h內(nèi)，陰道毛滴蟲的殺死率逐漸增高，即藥物的濃度和作用的時(shí)間同殺蟲效果呈正相關(guān)。若作用于患者體內(nèi)是否具有相同的效果，有待進(jìn)一步研究探索。