李文正，李梅云，吳興富，王丙武，高玉龍，隋學(xué)藝，趙璐，宋中邦

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗室/國家煙草基因工程研究中心，昆明 650021

生物堿是煙屬植物特征性次級代謝物，栽培煙草中生物堿主要為尼古?。╪icotine）、去甲基尼古丁（nornicotine）、假木賊堿（anabasine）和新煙草堿（anatabine）。尼古丁是首要的生物堿，占生物堿總含量的90%～95%，去甲基尼古丁由尼古丁經(jīng)過去甲基反應(yīng)生成（該過程通常被稱為尼古丁轉(zhuǎn)化），含量通常低于總生物堿的5%。去甲基尼古丁在煙葉烘烤、調(diào)制、貯存階段能夠被亞硝化生產(chǎn)NNN，后者在許多動物實(shí)驗中被證明與許多類型癌癥關(guān)聯(lián)，因此被WHO認(rèn)定為強(qiáng)致癌物[1-3]。此外，有研究表明去甲基尼古丁本身也能直接誘導(dǎo)吸煙者血漿中蛋白的異常糖基化，影響類固醇類藥物的藥效和毒性[4]。因此，抑制尼古丁轉(zhuǎn)化進(jìn)而降低去甲基尼古丁和NNN含量，是煙草減害的重要方向之一。

白肋煙去甲基尼古丁含量遠(yuǎn)高于烤煙，因此尼古丁轉(zhuǎn)化研究主要集中于白肋煙。白肋煙中存在一個目前仍未知的不穩(wěn)定基因座，導(dǎo)致去甲基尼古丁含量很低的白肋煙親代（非轉(zhuǎn)化株）也能產(chǎn)生去甲基尼古丁含量很高的子代（高轉(zhuǎn)化株），高轉(zhuǎn)化株中大部分尼古丁轉(zhuǎn)化生成去甲基尼古丁，比率甚至高達(dá)98%[5-6]。在生產(chǎn)實(shí)際中，每年需要投入大量的時間和經(jīng)費(fèi)淘汰尼古丁轉(zhuǎn)化率超過3%的單株，以控制白肋煙去甲基尼古丁含量[7]。尼古丁去甲基酶負(fù)責(zé)催化尼古丁轉(zhuǎn)化成去甲基尼古丁的反應(yīng)，迄今為止共有4個功能基因被克隆，分別為CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10、CYP82E21[8-11]。CYP82E21基 因 雖 能編碼具有活性的尼古丁去甲基酶，但僅在子房中表達(dá)，對葉片去甲基尼古丁含量影響不大，研究焦點(diǎn)主要集中在前3者[10]。用甲基磺酸乙酯（EMS）化學(xué)誘變策略獲得的CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10均發(fā)生突變的三突白肋煙材料，尼古丁轉(zhuǎn)化率僅為0.55%，和RNAi轉(zhuǎn)基因植株相當(dāng)[9,12-13]。Li等人針對上述3個基因的突變序列設(shè)計了CAPS和dCAPS標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，加快低NNN品種培育[14]。目前，美國已獲得眾多低NNN含量的白肋煙、深色煙、烤煙改良品種，卷煙工業(yè)研究表明低NNN煙葉能夠特異性降低混合型卷煙填料和主流煙氣的NNN含量[15]。

烤煙是中式卷煙的主要原料，降低其去甲基尼古丁含量進(jìn)而降低NNN含量對中式卷煙減害有重要意義[16]。但迄今為止關(guān)于烤煙去甲基尼古丁合成的研究較少，烤煙與白肋煙的合成機(jī)制是否一致目前尚無文獻(xiàn)報道。本研究借鑒白肋煙類似的策略，在烤煙品種云煙87的EMS突變體庫中篩選CYP82E2家族基因的突變體，獲得錯義突變體M594和M271，生物堿數(shù)據(jù)分析表明兩個突變體的尼古丁轉(zhuǎn)化率與對照相比顯著下降，這與白肋煙CYP82E10基因突變幾乎不影響尼古丁轉(zhuǎn)化率不同，表明烤煙與白肋煙的去甲基尼古丁合成機(jī)制不同。

1 材料與方法

1.1 EMS突變體庫創(chuàng)制

普通煙草云煙87種子參考已發(fā)表文獻(xiàn)的操作進(jìn)行EMS處理[9]，處理后種子作為M1代突變體種子進(jìn)行田間種植，套袋自交收獲M2代種子。大田種植約2200份M2代EMS突變體植株，采集葉片提取基因組，每8份DNA混樣，構(gòu)成8倍混合池，保存于96孔板，用于后續(xù)突變體篩選。

1.2 Tilling篩選條件

采用Primer 3軟件針對CYP82E10(NCBI登錄號：HM802352)基因第一個外顯子設(shè)計特異引物進(jìn)行Tilling篩選，正向引物為CYP82E10_Tilling_F：GTCAAATACCACCTCTTAATAGTAA，反 向 引 物 為CYP82E10_Tilling_R：AAAAGTCCCTATTGGTAGGAAGTGC，PCR產(chǎn)物大小為1335 bp。擴(kuò)增體系總體積為10 μL（TOYOBO預(yù)混液），其中包含20 ng DNA模板，0.8 mmol/L dNTP，1 單位 KOD FX Taq polymerase，320 nmol/L引物， 5 μL 2×KOD FX buffer。擴(kuò)增采用touchdown PCR，95 ℃預(yù)變性 2 min，98 ℃變性10 s，64 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，退火溫度每個循環(huán)依次降低1 ℃，共4個循環(huán)。隨后98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，共45個循環(huán)。最后68 ℃延伸5 min，4 ℃保持。

CEL1 酶切體系體積為 6 μL，包含 0.2 μL CEL1(1 unit), 1.2 μL 10× CEL1 buffer, 2 μL PCR 產(chǎn) 物 和2.6 μL 去 離 子 水。 采 用 AdvanCE FS96 (Advanced Analytical Technologies, USA)進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.3 突變位點(diǎn)Sanger測序驗證及功能預(yù)測

采集突變株幼嫩葉片組織，用DNA提取試劑盒（QIAGEN）提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，采用CYP82E10_Tilling_F和CYP82E10_Tilling_R引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物回收后直接進(jìn)行測序（Takara）。通過在線軟件PROVEAN Protein（http://provean.jcvi.org/seq_submit.php）對突變位點(diǎn)的功能損失進(jìn)行預(yù)測，PROVEAN得分小于-2.5表明突變會影響蛋白功能，大于-2.5表明突變對蛋白功能影響不大。利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行蛋白同源建模，分析高級結(jié)構(gòu)。

1.4 田間試驗設(shè)計及生物堿含量測定

2016—2017年，在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院研和試驗基地（云南玉溪）田間分別種植M4和M5代突變體和對照材料，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，每個材料設(shè)3個重復(fù)小區(qū)，每個小區(qū)栽煙約30株。種植密度、栽培調(diào)制技術(shù)及田間管理措施與當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)相同。各小區(qū)現(xiàn)蕾打頂，一周后一次性采集整株葉片60 ℃烘干，粉碎過60目篩待測。

內(nèi)標(biāo)喹啉、去甲基尼古丁購自Sigma-Aldrich公司，尼古丁購自TRC公司，檢測儀器為Bruker 450GC-300MS氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Bruker）。準(zhǔn)確稱取煙樣0.5 g于50 mL離心管中，加入5 mL 10%的NaOH溶液，搖勻，浸泡15 min，加入20 mL含內(nèi)標(biāo)的萃取液，超聲60 min，在離心機(jī)上5000 rpm/min離心5 min，取2 mL下層二氯甲烷清液過裝有2 g無水硫酸鈉的微孔過濾器后，用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 云煙87突變體庫創(chuàng)制

利用EMS誘變建立烤煙品種云煙87的突變體庫，大田種植約2200份M2代EMS突變體植株（圖1A）。采集葉片提取基因組DNA，并將所有樣品DNA濃度稀釋至40 ng/ μL（圖1B），最終建立了包含1842份M2代云煙87突變體的DNA庫。

圖1 EMS突變體庫構(gòu)建Fig.1 Development of EMS mutant population

2.2 CYP82E10基因突變體篩選

煙草CYP82E10基因由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成（圖2A），已被證明具有尼古丁去甲基酶活性。利用Tilling技術(shù)在突變體庫中篩選該基因發(fā)生突變的單株，共獲得11個突變株（圖2B），其中突變單株M594發(fā)生L115F突變，M271單株發(fā)生P129L突變（表1）。PROVEAN Protein分析表明M594單株突變PROVEAN得分為-3.06，M271單株突變PROVEAN得分為-3.16，2個突變均可能影響蛋白功能（表1）。構(gòu)建CYP82E10野生型及突變蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，發(fā)現(xiàn)M594單株中L115F突變發(fā)生在第4個α螺旋，M271單株中P129L突變發(fā)生在第5個α螺旋,2個突變均對蛋白三維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響（圖3A）。有預(yù)測表明CYP82E2家族蛋白中存在6個保守的底物識別結(jié)構(gòu)域[9,18]，L115F和P129L均位于第1個識別結(jié)構(gòu)域，因此極有可能影響酶與底物的結(jié)合（圖3B）。提取M3代突變單株葉片基因組DNA，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行Sanger測序驗證，M594和M271單株中均發(fā)現(xiàn)野生型、雜合突變、純合突變?nèi)N基因型（圖4）。將純合突變單株套袋自交獲得M4代種子，用于后續(xù)表型分析。

圖2 CYP82E10基因突變體篩選Fig.2 Identification of CYP82E10 mutants

表1 云煙87突變體庫中CYP82E10基因突變體統(tǒng)計Tab.1 Information of CYP82E10 mutants screened from EMS population of N.tabacum var.Yunyan87

圖3 突變蛋白結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測Fig.3 Structural and functional prediction of mutated protein

2.3 突變體材料尼古丁轉(zhuǎn)化率分析

田間種植突變材料和云煙87，隨機(jī)挑取10株進(jìn)行Sanger測序，結(jié)果表明M271和M594中CYP82E10基因突變均已純合，CYP82E4和CYP82E5基因未發(fā)生突變。煙株成熟后打頂，一周后采集整株葉片烘干分析尼古丁和去甲基尼古丁含量，并計算尼古丁轉(zhuǎn)化率（圖5）。M4代植株中，M594材料尼古丁轉(zhuǎn)化率是云煙87的45%，M271材料尼古丁轉(zhuǎn)化率是云煙87的38%。M5代植株中，M594材料尼古丁轉(zhuǎn)化率是云煙87的34%，M271材料尼古丁轉(zhuǎn)化率是云煙87的45%。這表明烤煙中CYP82E10蛋白的L115F，P129L突變能夠使其尼古丁去甲基酶活性減弱，造成煙葉中尼古丁轉(zhuǎn)化率顯著下降。M4、M5兩代突變體材料的尼古丁轉(zhuǎn)化率均比云煙87顯著降低，表明該性狀能夠穩(wěn)定遺傳。

圖4 突變體CYP82E10基因測序峰圖Fig.4 Sequence polymorphisms between mutant and wild type alleles in CYP82E10

圖5 突變體材料生物堿含量及尼古丁轉(zhuǎn)化率Fig.5 Alkaloids concentration and nicotine conversion rate in mutant lines

3 討論與結(jié)論

煙草中CYP82E2家族基因編碼尼古丁去甲基酶，催化尼古丁轉(zhuǎn)化生成去甲基尼古丁，是煙葉中致癌物NNN的前體物質(zhì)。國際上該領(lǐng)域的研究主要集中在美國北卡州立大學(xué)、肯塔基大學(xué)等機(jī)構(gòu)，主要研究材料是白肋煙。我國中式卷煙主要原料是烤煙，但目前尚未培育出低尼古丁轉(zhuǎn)化率烤煙材料和品種，烤煙尼古丁轉(zhuǎn)化機(jī)制也不清晰。本研究利用EMS處理獲得云煙87突變體庫，通過Tilling技術(shù)篩選獲得了CYP82E10基因的兩個錯義突變體M594和M271，并進(jìn)行尼古丁轉(zhuǎn)化率分析。

CYP82E4在白肋煙中是主效基因，其EMS終止突變株尼古丁轉(zhuǎn)化率為2.2%，遠(yuǎn)低于對照材料（＞60%）[9,12]。CYP82E5、CYP82E10基 因 單 突 及雙突材料的尼古丁轉(zhuǎn)化率與對照無顯著差異，但三突材料尼古丁轉(zhuǎn)化率為0.55%，比CYP82E4單突更低，和RNAi轉(zhuǎn)基因植株相當(dāng)[9,13]。本研究中烤煙CYP82E10基因的兩個錯義突變體M594和M271的尼古丁轉(zhuǎn)化率在連續(xù)2年的田間試驗中均比對照顯著降低，這表明烤煙和白肋煙的尼古丁轉(zhuǎn)化機(jī)制不完全一致?？緹烠YP82E4基因不表達(dá)，主要由CYP82E5和CYP82E10編碼的蛋白參與尼古丁的轉(zhuǎn)化，而CYP82E10突變體尼古丁轉(zhuǎn)化率顯著下降，表明CYP82E5無法互補(bǔ)CYP82E10的功能。其次，本研究CYP82E10基因并非發(fā)生無義突變但造成其催化活性下降或喪失，說明CYP82E10蛋白115位的亮氨酸和129位的脯氨酸對其立體構(gòu)象非常關(guān)鍵，突變可能造成底物尼古丁無法被結(jié)合。

NNN被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為強(qiáng)致癌物，是傳統(tǒng)卷煙的主要危害成分之一，降低其煙葉含量是煙草減害的重要目標(biāo)。此外，近年來隨著加熱不燃燒卷煙迅猛發(fā)展，由燃燒引起的有害成分大幅降低，煙葉內(nèi)源NNN，NNK等TSNA物質(zhì)的危害將更加突出。本研究獲得的低尼古丁轉(zhuǎn)化率材料中去甲基尼古丁含量顯著下降，目前正作為育種材料進(jìn)行自交和回交，培育低NNN烤煙新品種，為卷煙工業(yè)提供低危害煙葉原料。