陳少萍 王麗麗 梁藝堅

摘要：目的 建立通宣理肺丸中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量測定方法。方法 采用超高液相色譜法，色譜柱為ACE UItraCore SuperC18（75 mm×2.1 mm，2.5 ?m），流動相為甲醇-水，梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，檢測波長為321 nm，柱溫為40 ℃。結(jié)果 白花前胡甲素、白花前胡乙素分別在20.48～204.8 ng（r=0.999 7）、5.158～51.58 ng（r=1.000 0）范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，加樣回收率分別為98.2%、100.3%。結(jié)論 該方法簡便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于通宣理肺丸中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量測定。

關(guān)鍵詞：白花前胡甲素；白花前胡乙素；通宣理肺丸；超高液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.018

中圖分類號：R284.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）09-0076-03

Abstract： Objective To establish a method for content determination of praeruptorin A and praeruptorin B in Tongxuan Lifei Pills. Methods UPLC method was adopted. ACE UItraCore SuperC18 （75 mm × 2.1 mm， 2.5 μm） was used with methanol-water as the mobile phase， by gradient elute. The flow rate was 0.3 mL/min； The detection wavelength was set at 321 nm； The column temperature was 40 ℃. Results Praeruptorin A and praeruptorin B showed the good linear relationship in the range of 20.48–204.8 ng （r=0.999 7） and 5.158–51.58 ng （r=1.000 0）， respectively. The average recoveries were 98.2% and 100.3%， respectively. Conclusion The method is simple， fast， accurate and reproducible， which can be used to determine the contents of praeruptorin A and praeruptorin B in Tongxuan Lifei Pills.

Keywords： praeruptorin A； praeruptorin B； Tongxuan Lifei Pills； UPLC

通宣理肺丸由紫蘇葉、前胡、桔梗等11味藥組成，具有解表散寒、宣肺止嗽功效，用于風(fēng)寒束表、肺氣不宣所致感冒咳嗽，癥見發(fā)熱、惡寒、咳嗽、鼻塞流涕、頭痛、無汗、肢體酸痛[1]1452。前胡為方中臣藥，具降氣化痰、散風(fēng)清熱之功效，用于痰熱喘滿咯痰黃稠、風(fēng)熱咳嗽痰多[1]265。前胡的主要成分為香豆素類化合物，白花前胡甲素和白花前胡乙素是前胡的有效成分。已有文獻報道通宣理肺丸中陳皮、枳殼、黃芩、苦杏仁、甘草等含量測定方法[2-7]，而對方中前胡的測定尚無報道。2015年版《中華人民共和國藥典》前胡的含量測定采用三氯甲烷提取白花前胡甲素和白花前胡乙素，而三氯甲烷毒性較大，在新版藥典中逐步采用其他溶劑替換。本研究建立甲醇提取、中性氧化鋁柱凈化測定通宣理肺丸中白花前胡甲素和白花前胡乙素含量的方法，以提升通宣理肺丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，改進該制劑的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1290高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），KM-1990QFY智能型液晶數(shù)控型超聲波清洗機（威固特新型設(shè)備有限公司），GR-202電子分析天平（日本A&D;公司）。

白花前胡甲素對照品（批號111711-200602，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%）、白花前胡乙素對照品（批號111904- 201102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%），中國食品藥品檢定研究院；通宣理肺丸（批號151102、161101、161102），廣西梧州三鶴藥業(yè)股份有限公司；中性氧化鋁（批號20140401），江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

采用ACE UItraCore SuperC18色譜柱（75 mm×2.1 mm，2.5 ?m），流動相為甲醇-水，梯度洗脫（0～5 min，40%～60%甲醇；5～5.3 min，60%甲醇；5.3～6 min，60%～70%甲醇），流速0.3 mL/min，檢測波長321 nm，柱溫40 ℃，進樣量2 ?L。

分別取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，注入液相色譜儀，理論塔板數(shù)以白花前胡甲素計不低于5000，白花前胡甲素和白花前胡乙素與其他組分色譜峰分離度均大于1.5，陰性對照不干擾樣品測定。色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取白花前胡甲素、白花前胡乙素對照品適量，加甲醇溶解并定容，制成濃度分別為2.048、0.412 6 mg/mL的對照品貯備液，分別精密吸取白花前胡甲素對照品貯備液0.2 mL、白花前胡乙素對照品貯備液0.25 mL置于10 mL量瓶中，制得混合對照品溶液（白花前胡甲素40.96 ?g/mL、白花前胡乙素10.315 ?g/mL）。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品裝量差異下的大蜜丸，剪碎，混勻，取24.0 g，加入硅藻土12.0 g，研勻，粉碎成粗粉，取13.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率25 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液5 mL，加在中性氧化鋁柱（100～200目，5 g，內(nèi)徑為1 cm）上，用正己烷30 mL洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備

按處方配比，制備不含前胡的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對照品溶液0.5、1、2、3、4、5 ?L注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定，以對照品濃度（ng）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程。白花前胡甲素：Y=16.200 2X-4.9（r=0.999 7）；白花前胡乙素：Y=14.716X-1.16（r=1.000 0）。白花前胡甲素和白花前胡乙素分別在20.48～204.8 ng和5.158～51.58 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，每次2 ?L，按“2.1”項下色譜條件測定其峰面積，結(jié)果白花前胡甲素、白花前胡乙素RSD分別為0.22%、0.20%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗

取同一批號（161102）樣品，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算白花前胡甲素、白花前胡乙素的含量，結(jié)果二者的平均含量分別為0.232、0.063 mg/g，RSD分別為0.25%、0.67%。表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，結(jié)果白花前胡甲素、白花前胡乙素的RSD分別為0.40%、0.70%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗

取同一批號（161102）樣品6份，每份6.75 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入白花前胡甲素對照品貯備液0.6 mL、白花前胡乙素對照品貯備液0.7 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算回收率，結(jié)果見表1、表2。

2.8 樣品含量測定

取不同批號的3批樣品，每批3份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算含量，結(jié)果見表3。

3 討論

白花前胡甲素和白花前胡乙素為香豆素類化合物，可溶于熱水、甲醇、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等有機溶劑。考慮到本品為丸劑，水提含糖雜質(zhì)較多，三氯甲烷毒性較大，故本試驗考察了以甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯為提取溶劑的提取效果，結(jié)果以甲醇為溶劑的提取率最高，故提取溶劑選擇甲醇。

本試驗考察了超聲、回流和索氏提取3種提取方式，結(jié)果超聲45 min、回流2 h和索氏提取3 h的提取效率無明顯差異，由于超聲簡便、易操作，故選擇超聲提取。同時，對超聲提取時間（30、45、60 min）和提取溶劑用量（25、50、100 mL）進行了考察，結(jié)果顯示，加入甲醇50 mL、超聲提取45 min可將樣品中白花前胡甲素和白花前胡乙素提取完全。

本試驗采用中性氧化鋁柱凈化，考察了洗脫溶劑的種類（甲醇、乙酸乙酯、正己烷）和用量，結(jié)果采用甲醇、乙酸乙酯、正己烷除雜待測成分均能洗脫完全，但2 min之前的雜質(zhì)峰響應(yīng)依次降低，雜質(zhì)峰降低對基線的影響較小，定量更準(zhǔn)確，因此選擇正己烷30 mL洗脫。

本試驗采用二極管陣列檢測器在200～400 nm波長范圍內(nèi)對白花前胡甲素和白花前胡乙素進行掃描，結(jié)果顯示，二者在254、321 nm均有最大吸收，254 nm處基線噪音較大，干擾待測成分的檢測，而321 nm處基線平穩(wěn)，靈敏度高，故選擇321 nm為檢測波長。

《中華人民共和國藥典》曾將前胡和紫花前胡均收載為前胡使用，2005年版前胡項下刪掉了紫花前胡的植物來源，2010年版起將二者分別收載，紫花前胡的指標(biāo)成分為紫花前胡苷，應(yīng)避免與前胡混用。本研究建立了前胡特征成分的檢測方法，能有效控制通宣理肺丸制劑中前胡的質(zhì)量。

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（收稿日期：2017-12-10）

（修回日期：2018-01-16；編輯：陳靜）