倪新強(qiáng) 廖穎釗 李利民

摘要：目的 觀察針刺“三陰交”“百會(huì)”對(duì)注意缺陷多動(dòng)障礙（ADHD）模型大鼠行為學(xué)及前額葉皮質(zhì)中多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）含量的影響，探討針刺防治ADHD的作用機(jī)制。方法 4周齡SHR大鼠隨機(jī)分為模型組、西藥組、針刺組，同周齡WKY大鼠設(shè)為正常組，每組10只，針刺組針刺大鼠“三陰交”“百會(huì)”，留針15 min；西藥組大鼠每日予利他林2 mg/kg灌胃，在大鼠夜周期連續(xù)干預(yù)4周。采用開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮、新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠自發(fā)性行為、沖動(dòng)行為及學(xué)習(xí)記憶能力，高效液相色譜法檢測(cè)前額葉皮質(zhì)中DA、NE、5-HT水平。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠各項(xiàng)行為學(xué)參數(shù)均明顯升高（P<0.05），前額葉皮質(zhì)中DA、NE及5-HT水平明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，針刺組大鼠開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總運(yùn)動(dòng)距離、理毛次數(shù)及直立次數(shù)，高架十字迷宮開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)百分比和開(kāi)放臂停留時(shí)間百分比均明顯減少（P<0.05），新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)對(duì)新物體偏好指數(shù)明顯增高（P<0.05），前額葉皮質(zhì)中NE、5-HT水平明顯升高（P<0.05）。結(jié)論 針刺“百會(huì)”“三陰交”可減少ADHD模型大鼠自發(fā)性活動(dòng)及沖動(dòng)行為，增強(qiáng)其學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與提高前額葉皮質(zhì)中NE、5-HT水平相關(guān)。

關(guān)鍵詞：注意缺陷多動(dòng)障礙；針刺；去甲腎上腺素；5-羥色胺；多巴胺；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.010

中圖分類(lèi)號(hào)：R245 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）09-0039-05

Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture at “Sanyinjiao” （SP6） and “Baihui” （GV20） on behaviors and contents of monoamine neurotransmitter dopamine （DA）， noradrenalin （NE） and 5-hydroxytrypamine （5-HT） in prefrontal cortex （PFC） of attention deficit hyperactivity disorder （ADHD） rats； To discuss mechanism of action of acupuncture for prevention and treatment of ADHD. Methods 4-week-old SHR rats were randomly divided into the model group， Western medicine group and acupuncture group， and WKY rats with the same age were selected as the normal control group， with 10 rats in each group. Acupuncture was applied to “Sanyinjiao” （SP6） and “Baihui” （GV20） of rats in acupuncture group for 15 min. The rats in Western medicine group was given MPH （ritalin） for gavage， and rats were treated for 4 weeks in the dark-phase. Open field test （OFT）， elevated plus maze （EPM） and novel object recognition test （NORT） were conducted to evaluate the spontaneous activity， impulsivity and learning-memorial ability of rats individually at the end of treatment. Contents of DA， NE and 5-HT in PFC were detected by HPLC. Results Compared with the normal control group， all of the behavior parameters of rats in model group were significantly higher （P<0.05）， and the contents of DA， NE and 5-HT in PFC of model group were lower than those of normal control group （P<0.05）. Compared with the model group， acupuncture group showed shorter movement distance， less rearing and fewer grooming activities in the OFT； percentages of times of entering the open arms and staying duration were reduced in the total period in the EPM； preference index in the NORT was elevated （P<0.05）； the contents of NE and 5-HT in PFC of acupuncture group increased significantly （P<0.05）. Conclusion Acupuncture at “Sanyinjiao” （SP6） and “Baihui” （GV20） canreduce the spontaneous activity and impulsivity， and improve learning and memory ability of ADHD model rats， which may be related to elevated contents of NE and 5-HT in the PFC.

Keywords： attention deficit hyperactivity disorder； acupuncture； noradrenalin； 5-hydroxytrypamine； dopamine； rats

注意缺陷多動(dòng)障礙（attentional deficit hyperactivity disorder，ADHD）為兒童期最常見(jiàn)的行為障礙性疾病，目前，常規(guī)西藥治療不良反應(yīng)較大。研究發(fā)現(xiàn)，由前額葉皮質(zhì)、尾狀核及小腦組成調(diào)控注意、情緒及行為的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)參與了ADHD病機(jī)發(fā)展[1]，與此神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)神經(jīng)元功能紊亂導(dǎo)致的單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)如多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）及5-羥色胺（5-HT）活動(dòng)改變進(jìn)一步導(dǎo)致ADHD的病理改變[2]。大量臨床研究表明，針刺單用或配合常規(guī)藥物及行為療法治療ADHD優(yōu)于單純常規(guī)藥物和行為療法[3-4]，但其作用機(jī)制迄今尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察針刺對(duì)ADHD模型大鼠行為學(xué)（自發(fā)性活動(dòng)、沖動(dòng)、學(xué)習(xí)記憶）的影響，初步探討其是否通過(guò)調(diào)控前額葉皮質(zhì)中DA、NE及5-HT水平發(fā)揮其療效，為臨床上用于治療ADHD提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

SPF級(jí)SHR大鼠40只，WKY大鼠10只，均為雄性，3周齡，體質(zhì)量（40±10）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于明暗交替12 h/12 h、溫度20～22 ℃、相對(duì)濕度（50±10）%的SPF級(jí)動(dòng)物房，自由攝食飲水。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后編號(hào)，先采用開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)觀察大鼠自發(fā)性行為[5]，按動(dòng)物5 min內(nèi)總運(yùn)動(dòng)距離分層隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)[6]，Excel2010產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字，將動(dòng)物按5 min內(nèi)總運(yùn)動(dòng)距離升序排序，按順序每3只動(dòng)物分為1個(gè)區(qū)組，共分成10個(gè)區(qū)組，每一區(qū)組中3只大鼠再按隨機(jī)數(shù)升序依次分入3個(gè)隨機(jī)組中，3個(gè)隨機(jī)組中每組分到10只動(dòng)物，進(jìn)而將SHR大鼠分為模型組、西藥組、針刺組，每組10只。WKY大鼠作為正常組。

1.2 主要試劑與儀器

標(biāo)準(zhǔn)品DA（批號(hào)H8502）、NE（批號(hào)A7257）和5-HT（批號(hào)H9523），色譜甲醇、色譜乙腈，美國(guó)Sigma公司；乙二胺四乙酸、磷酸二氫鉀，北京索萊寶科技有限公司。開(kāi)場(chǎng)試驗(yàn)箱（63007型）、高架十字迷宮（63009型）、Barnes迷宮（63027型）、SMART 3.0小動(dòng)物行為學(xué)視頻采集與分析系統(tǒng)，美國(guó)Panlab公司；Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)Agilent公司；CoulochemⅢ電化學(xué)檢測(cè)器，美國(guó)ESA公司；Q700智能型超聲波破碎儀，美國(guó)Qsonica公司；華佗牌無(wú)菌一次性針具，蘇州醫(yī)療用品廠(chǎng)有限公司，規(guī)格0.16 mm×7 mm。

1.3 干預(yù)

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始干預(yù)。針刺組：用特制棉布袋將大鼠立位固定于木架上，暴露四肢，取“百會(huì)”“三陰交”，定位及針刺操作參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]?！鞍贂?huì)”向尾部斜刺，“三陰交”向后爪部斜刺5 mm，每穴行均勻捻轉(zhuǎn)刺激30 s；施針時(shí)用手輕輕安撫大鼠固定其頭部，減少額外刺激；留針15 min，間隔5 min行針1次，頻率120～150 次/min，每日1次。正常組和模型組均以相同方法束縛但不進(jìn)行針刺。西藥組：利他林（MPH速釋劑型，購(gòu)于Novartis，批號(hào)NDC 0078-0440-05）每日灌胃2 mg/kg，用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配制成混懸液，超聲溶解，1日量分2次灌胃（大鼠夜周期9：30-10：30、15：30-16：30時(shí)）。連續(xù)干預(yù)4周。20 W可夾式紅色電燈用以在抓取動(dòng)物、行針及灌胃時(shí)照明[8]。

1.4 行為學(xué)檢測(cè)

當(dāng)日首次給藥30 min后在大鼠夜周期進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。動(dòng)物分組對(duì)動(dòng)物行為學(xué)操作人員設(shè)盲，過(guò)程中保持周邊光線(xiàn)和噪聲的一致性；每只大鼠測(cè)試完后用75%乙醇及時(shí)擦拭迷宮，清除糞便及氣味，以免干擾下只大鼠測(cè)試。

1.4.1 開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

采用內(nèi)壁100 cm×100 cm×50 cm的木質(zhì)敞箱，通過(guò)軟件將箱底設(shè)置成25個(gè)方格（20 cm×20 cm）。測(cè)試開(kāi)始時(shí)將大鼠放在開(kāi)場(chǎng)箱底部中央，通過(guò)視頻分析系統(tǒng)自動(dòng)記錄其5 min內(nèi)總運(yùn)動(dòng)距離（cm）、直立次數(shù)（大鼠前爪騰空或攀附開(kāi)場(chǎng)箱側(cè)壁計(jì)為1次）、理毛次數(shù)及排糞次數(shù)。

1.4.2 高架十字迷宮

高架十字迷宮由2個(gè)開(kāi)放臂（30 cm×5 cm）和2個(gè)閉合臂（30 cm×5 cm×40 cm）組成，整個(gè)設(shè)備高于地面50 cm。測(cè)試時(shí)將大鼠頭朝開(kāi)放臂方向放在四臂交叉的中央?yún)^(qū)，高架十字迷宮頂部強(qiáng)光源始終打開(kāi)。記錄5 min內(nèi)活動(dòng)指標(biāo)：開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)（必須2只前爪進(jìn)入臂內(nèi)）、開(kāi)放臂停留時(shí)間、閉合臂進(jìn)入次數(shù)、閉合臂停留時(shí)間、高架十字迷宮總進(jìn)入次數(shù)、開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)比（開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)與迷宮總進(jìn)入次數(shù)比值）、開(kāi)放臂停留時(shí)間比（開(kāi)放臂進(jìn)入時(shí)間與迷宮總進(jìn)入時(shí)間比值）。

1.4.3 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)是基于哺乳類(lèi)動(dòng)物易趨向于新穎事物的天性而評(píng)估學(xué)習(xí)記憶功能[9]。測(cè)試流程分訓(xùn)練期及測(cè)試期：在訓(xùn)練期，測(cè)試箱內(nèi)放入形狀、顏色及大小相同的2個(gè)物體，對(duì)稱(chēng)固定于底部對(duì)角線(xiàn)上（外1/3處），然后將大鼠背朝兩物體（大鼠鼻尖距離兩物體的長(zhǎng)度一致）放入測(cè)試箱3 min，當(dāng)大鼠嘴部或鼻部朝向物體且在距離物體1 cm范圍內(nèi)時(shí)，即被認(rèn)為探索物體，記錄大鼠在此階段對(duì)2個(gè)相同物體的探索時(shí)間；1 d后進(jìn)入測(cè)試期，將其中一物體換成顏色和形狀均不相同但大小相同的新穎物體（保持新物體在測(cè)試盒內(nèi)位置不變），記錄5 min內(nèi)大鼠對(duì)新穎物體與熟悉物體的探索時(shí)間。采用偏好指數(shù)（preference index，PI），即大鼠在訓(xùn)練期探索其中一個(gè)物體或測(cè)試期探索新物體的時(shí)間與探索兩物體總時(shí)間的比值作為評(píng)價(jià)大鼠記憶能力的指標(biāo)。

1.5 單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量測(cè)定

末次給藥后1 h，CO2麻醉斷頭處死大鼠，根據(jù)大鼠腦立體定位圖，冰臺(tái)上快速剖取大腦，分離出前額葉皮質(zhì)，冰生理鹽水清洗，濾紙吸干表面水分。稱(chēng)取100 mg左右前額葉皮質(zhì)，放入1 mL冰冷0.1 mol/L高氯酸溶液（含0.5 mmol /L EDTA、0.01%半胱氨酸）中，冰浴中勻漿離心（4 ℃、3000×g，20 min，取上清液繼續(xù)離心（室溫、12 000×g，3 min），取上清液、以針頭式過(guò)濾器（0.45 μm）過(guò)濾，取濾液以去離子雙蒸水1∶4稀釋后進(jìn)行NE、5-HT和DA高效液相-電化學(xué)檢測(cè)。檢測(cè)條件：色譜柱采用Phenomenex Luna C18反相柱（50 mm×2.0 mm×3 μm），流動(dòng)相含磷酸二氫鈉49.9 mmol/L、EDTA 200 μmol/L、辛烷磺酸鈉鹽0.2 mmol/L、氯化鈉9.9 mmol/L、甲醇100 mL、超純水（pH 2.6）900 mL，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，工作電壓0.7 V。所有數(shù)據(jù)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)及組間方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊，組間比較用方差分析，數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊則用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 針刺對(duì)SHR大鼠自發(fā)性活動(dòng)的影響

與正常組比較，模型組大鼠總運(yùn)動(dòng)距離、直立次數(shù)、理毛次數(shù)及排糞次數(shù)明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，針刺組和西藥組大鼠總運(yùn)動(dòng)距離、直立次數(shù)及理毛次數(shù)明顯減少（P<0.05），針刺組大鼠總運(yùn)動(dòng)距離少于西藥組（P<0.05），兩組直立次數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；各組SHR大鼠排糞次數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 針刺對(duì)SHR大鼠沖動(dòng)行為的影響

各組SHR大鼠進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)比及開(kāi)放臂停留時(shí)間比較正常組均明顯增加（P<0.05）；西藥組及針刺組大鼠開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)比及開(kāi)放臂停留時(shí)間比較模型組均明顯減少（P<0.05）；針刺組大鼠較西藥組開(kāi)放臂停留時(shí)間比明顯減少（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 針刺對(duì)SHR大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

在訓(xùn)練期，各組大鼠對(duì)2個(gè)相同物體探索時(shí)間相似（P>0.05），對(duì)物體無(wú)明顯偏好選擇。在測(cè)試期，各組SHR大鼠PI均明顯高于正常組（P<0.05），針刺組大鼠對(duì)新物體探索時(shí)間較模型組明顯增加（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 針刺對(duì)SHR大鼠前額葉皮質(zhì)中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響

與正常組比較，模型組大鼠DA、NE、5-HT含量明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，針刺組和西藥組大鼠NE、5-HT含量明顯增加（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

ADHD屬中醫(yī)學(xué)“臟躁”“煩躁”等范疇?！端貑?wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論篇》謂“陰?kù)o陽(yáng)躁”，即陰主柔靜，陽(yáng)主剛躁，兩者充盛和諧，則機(jī)體調(diào)節(jié)功能（如動(dòng)與靜、興奮與抑制、亢進(jìn)與減退等）協(xié)調(diào)無(wú)病。小兒ADHD系由陰陽(yáng)動(dòng)靜失衡而致，即陰?kù)o不足，陰不制陽(yáng)而致神不靈、魂不安、意不固、志不堅(jiān)?！鹅`樞·根結(jié)》云：“用針之要，在于知調(diào)陰與陽(yáng)?！惫梳槾讨委烝DHD應(yīng)以頭部腧穴及陰經(jīng)腧穴為主，以期益精填髓、調(diào)和陰陽(yáng)、安神定志。交會(huì)穴為多經(jīng)經(jīng)氣匯聚之處，可起到調(diào)諸經(jīng)的目的?！安∽?cè)谀X，首取督脈”，而百會(huì)為督脈、足太陽(yáng)、足少陽(yáng)、手少陽(yáng)及足厥陰之會(huì)，百會(huì)又可通過(guò)足太陽(yáng)經(jīng)的背俞穴與五臟六腑經(jīng)氣相通，取之能填精益髓、疏通腦絡(luò)、醒神開(kāi)竅；三陰交為足三陰之會(huì)，可通調(diào)肝、脾、腎臟腑精氣。故合用百會(huì)、三陰交治療ADHD，可達(dá)通督調(diào)神、益智復(fù)聰之功。因此，臨床治療兒童ADHD時(shí)多注重對(duì)這兩穴的應(yīng)用，以提高療效。

本實(shí)驗(yàn)選擇在逆轉(zhuǎn)的暗周期（大鼠清醒周期）里，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行MPH治療及其他干預(yù)，以模仿臨床MPH用藥方案（ADHD患兒在晝夜節(jié)律的“活動(dòng)期”接受MPH治療）[10-11]。開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的總運(yùn)動(dòng)距離、直立次數(shù)、理毛次數(shù)分別反映動(dòng)物的自發(fā)性活動(dòng)、對(duì)新奇環(huán)境的探究程度及情緒緊張程度。本研究發(fā)現(xiàn)，針刺可明顯減少SHR大鼠在逆轉(zhuǎn)的暗周期運(yùn)動(dòng)距離、直立次數(shù)及理毛次數(shù)，而對(duì)同樣反映情緒緊張程度的排糞次數(shù)沒(méi)有影響。焦慮相關(guān)的沖動(dòng)采用高架十字迷宮評(píng)估，進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)及停留時(shí)間的增加可能反映了沖動(dòng)[12-13]，本研究中SHR大鼠進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)及停留時(shí)間均多于正常組WKY大鼠，表明SHR大鼠可表現(xiàn)出ADHD樣的沖動(dòng)行為；MPH及針刺均能減少SHR大鼠進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)及停留時(shí)間，針刺更能減少SHR大鼠進(jìn)入開(kāi)放臂停留時(shí)間，表明針刺較MPH更能減輕SHR大鼠的沖動(dòng)行為。

有研究發(fā)現(xiàn)，3周齡大鼠（品系不詳）連續(xù)21 d（周末停用）口服MPH3（5 mg/kg，每日2次），大鼠未表現(xiàn)出對(duì)新穎物體明顯偏好[14]，而Heyser C J等[15]也發(fā)現(xiàn)對(duì)斷乳期（21日齡）和圍青春期（34日齡）的SD大鼠連續(xù)7 d腹腔注射MPH（5 mg/kg，每日2次），可損傷其識(shí)別記憶功能，但因腹腔注射釋放藥物較迅速，其給藥途徑對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響與藥物口服可能不同[16]。而本研究中，西藥組與針刺組大鼠對(duì)新穎物體PI顯著高于模型組，表明長(zhǎng)期口服MPH及針刺治療均可增強(qiáng)SHR大鼠記憶能力，而MPH對(duì)SHR大鼠記憶學(xué)習(xí)能力改善結(jié)果與上述報(bào)道不同，可能與MPH給藥途徑、動(dòng)物品系等不同有關(guān)。

ADHD病理機(jī)制尚未明確，研究發(fā)現(xiàn)腦組織內(nèi)主要神經(jīng)遞質(zhì)（如DA、5-HT）與沖動(dòng)行為的調(diào)控有關(guān)[17-18]，背側(cè)紋狀體DA信號(hào)中多巴胺D1受體降低可減輕沖動(dòng)，青春期長(zhǎng)期給予MPH可增強(qiáng)SHR大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)中DA轉(zhuǎn)運(yùn)體功能，而MPH治療停止后仍可減少成年期細(xì)胞外DA的水平[19]。降低的中樞5-HT信號(hào)增加大鼠沖動(dòng)行為及選擇，中縫背核5-HT神經(jīng)元的藥理學(xué)及光遺傳活化可降低選擇沖動(dòng)[20]。學(xué)習(xí)記憶部分依賴(lài)于前額葉皮質(zhì)的功能整合，其很大程度上依賴(lài)于突觸DA及NE的最優(yōu)水平；研究發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠前額葉皮質(zhì)中NE釋放減少[21]，而MPH被認(rèn)為可保持DA及NE的水平。可恢復(fù)體內(nèi)兒茶酚胺釋放未達(dá)最優(yōu)水平個(gè)體的認(rèn)知功能[22]。本研究中，針刺組及西藥組大鼠前額葉皮質(zhì)中NE、5-HT較模型組明顯升高（P<0.05），針刺組大鼠前額葉皮質(zhì)中DA含量與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明針刺“百會(huì)”“三陰交”可能通過(guò)增加SHR大鼠前額葉皮質(zhì)中NE、5-HT含量而減輕大鼠夜周期多動(dòng)及沖動(dòng)行為、增強(qiáng)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

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（收稿日期：2018-03-25）

（修回日期：2018-04-08；編輯：華強(qiáng)）