范穎，趙鑫，李娜，吳曼曼，李新莉，*

（1.大連醫(yī)科大學(xué)臨床技能中心，遼寧大連116044；2.大連醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)系，遼寧大連116044）

酒精性肝損傷是酒精攝入過量（急性）或長期酗酒（慢性）導(dǎo)致的中毒性肝病[1]，影響著全世界數(shù)百萬人口，是導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率的主要原因[2]。肝臟與腸道之間存在“腸——肝”軸[3]，在肝損傷的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究中，腸道菌群發(fā)揮著重要作用，腸道與肝損傷之間的相互促進(jìn)相互影響的關(guān)系也逐漸被闡明。如腸道菌群參與酒精的代謝，將乙醇轉(zhuǎn)化為有毒性的、高濃度的乙醛，導(dǎo)致腸道的通透性增加，打破了腸道菌群的平衡，革蘭陰性菌過度生長，產(chǎn)生的內(nèi)毒素誘導(dǎo)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α），激活誘導(dǎo)型一氧化氮合酶系統(tǒng)（inducible nitric oxide synthase system，iNOS），加重了腸道的炎癥反應(yīng)，而NO的大量合成又促進(jìn)了肝臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成肝臟的進(jìn)一步損傷[4]。過量飲酒導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)，成為酒精性肝病的潛在發(fā)病機(jī)制，而腸道菌群失調(diào)造成內(nèi)毒素升高也是造成肝臟損傷的重要發(fā)病原因。蔡夏夏等[5]研究表明酒精性肝損傷動(dòng)物腸道菌群改變，出現(xiàn)肝臟脂肪變性及腸道上皮細(xì)胞屏障功能障礙等，通過補(bǔ)充天然活性成分能夠刺激雙歧桿菌等益生菌的生長，具有益生元的作用。Chen等[6]發(fā)現(xiàn)肝損傷患者服用乳糖醇可以增加乳酸桿菌和雙歧桿菌，抑制條件致病菌的生長而減少內(nèi)毒素的產(chǎn)生。因此益生菌和益生元具有減輕肝臟的損傷，改善肝臟功能的作用。

大蒜（Allium Sativum L.）為百合科蔥屬植物的鱗莖，是生活中常用的香辛料和調(diào)味品，其主要活性成分為大蒜素和大蒜多糖（garlic polysaccharide，Gp）。大蒜素具有抗菌、調(diào)血脂、降血糖、抗腫瘤、抗衰老等功能[7]，且對(duì)酒精性肝損傷具有保護(hù)作用[8]。大蒜多糖來源于大蒜素提取之后的殘?jiān)?，具有抗病毒、抗氧化、護(hù)肝、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長等作用[9]。

人體腸道細(xì)菌以厭氧菌為主，傳統(tǒng)的微生物技術(shù)僅能反映腸道菌群數(shù)目變化這一指標(biāo)，更有超過70%的腸道菌群無法通過傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定，不能反映腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性和種群變化，因此，腸桿菌基因間重復(fù)共有序列基因擴(kuò)增（enter obacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)——變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）等分子生物學(xué)方法被廣泛用于菌群結(jié)構(gòu)及種群變化，具有靈敏度高、可重復(fù)性、可靠性好，省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)。

用大蒜多糖對(duì)小鼠預(yù)防給藥30 d，使用56°紅星二鍋頭灌胃小鼠建立急性酒精性肝損傷模型，ERICPCR和PCR-DGGE技術(shù)研究大蒜多糖對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠腸道菌群的影響，分析腸道菌群結(jié)構(gòu)的相似性和多樣性，鑒定優(yōu)勢(shì)菌屬序列。以腸道菌群作為治療酒精性肝病的潛在作用靶點(diǎn)，初步探討大蒜多糖預(yù)防酒精性肝損傷的可能作用機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)保肝護(hù)肝藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮大蒜：市售；護(hù)肝片：長春海外制藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)：Z22020994，規(guī)格：0.35g；北京 56°紅星二鍋頭：北京紅星股份有限公司；糞便細(xì)菌DNA提取試劑盒：成都福際生物技術(shù)有限公司；GC-341f（5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG）、518r（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG）、ERIC-1（ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC）、ERIC-2（AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG）：英濰捷基上海貿(mào)易有限公司；PCR-Mix：大連優(yōu)萌威貿(mào)易有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、去離子甲酰胺、瓊脂糖、溴化乙錠（EB）：大連羽銘生物科技有限公司；DL2000 Marker、DL100 Marker：大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UVS-1渦旋振蕩器：北京優(yōu)晟科技有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)（離心半徑6 cm）：安徽中科中佳科學(xué)有限公司；JY-spat瓊脂糖水平電泳儀、DGGE電泳儀：大連競邁設(shè)備有限公司。

1.3 大蒜多糖的制備

200 g新鮮大蒜提取大蒜素后的殘?jiān)?，按料液? ∶4（g/mL）加入水 800 mL，80℃水浴 2 h，雙層紗布過濾，濾液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至300 mL，加入無水乙醇使其終濃度為70%，4℃過夜，5 000 r/min離心15 min得到白色沉淀，冷凍干燥即得大蒜多糖（Gp）。

1.4 模型建立與分組

SPF級(jí)KM小鼠，雌雄各半，體重18 g～22 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（遼）2013-0002，本實(shí)驗(yàn)通過大連醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)同意。護(hù)肝片和大蒜多糖分別溶于生理鹽水配成護(hù)肝片溶液（6 mg/mL）、大蒜多糖高濃度（25 mg/mL）和低濃度（15 mg/mL）溶液[10]。小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（N）、急性肝損傷組（A）、護(hù)肝片組（P）、大蒜多糖高（GpH）、低濃度組（GpL），每組8只。除N組和A組，其余各組灌服0.2 mL相應(yīng)藥物30 d，末次給藥30分鐘后，正常對(duì)照組灌服生理鹽水，其他組灌胃14 mL/kg紅星二鍋頭建立急性酒精性肝損傷模型，12小時(shí)后取每只小鼠糞便，于80℃保存。

1.5 糞便細(xì)菌DNA提取

使用試劑盒提取每只小鼠糞便細(xì)菌DNA，按說明書進(jìn)行操作。

1.6 ERIC-PCR擴(kuò)增

使用ERIC-PCR上、下游引物ERIC-1和ERIC-2，擴(kuò)增體系（25μL）為：2×EasyTaqPCRSuperMix 12.5 μL，10 μmol/L 的上下游引物各 0.5 μL，DNA 模板 2 μL，去離子水補(bǔ)充至25 μL。PCR程序：預(yù)變性94℃5 min；變性94℃50 s，退火49℃ 30 s，46℃ 30 s，延伸72℃3 min，35個(gè)循環(huán)；充分延伸72℃9 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)品用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以2 000 bp Marker為參照。

1.7PCR-DGGE電泳

使用16S rRNA基因V3可變區(qū)上、下游引物GC-341f和518r，擴(kuò)增體系同1.5。PCR程序：預(yù)變性94℃5 min；變性 94 ℃ 30 s，退火 54 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；充分延伸72℃7 min。采用8%丙烯酰胺凝膠配制25%～50%DGGE變性梯度凝膠 [其中100%濃度變性梯度凝膠含40%（體積分?jǐn)?shù)）去離子甲酰胺和7 mol/L尿素]，取10 μL PCR產(chǎn)物于DGGE膠，60℃、70 V電泳5 h，電泳后取出凝膠使用0.125‰EB染色，拍照。

1.8 差別條帶序列分析

切下PCR-DGGE圖譜中的優(yōu)勢(shì)條帶，加入20 μL無菌水搗碎，于95℃浸泡10 min，37℃過夜，取上清液做模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為341f和518r，PCR反應(yīng)體系和程序同1.6。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast對(duì)比分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Quantity One 4.6.2軟件分析ERIC-PCR圖譜中主要條帶的分子量，對(duì)PCR-DGGE圖譜進(jìn)行UPGMA相似性聚類分析和多樣性分析，所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 10.0軟件包處理，正態(tài)計(jì)量指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P值＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 EIRC-PCR圖譜分析

大蒜多糖對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)防給藥30天后建立急性酒精性肝損傷模型，腸道菌群ERIC-PCR指紋圖譜如圖1所示。

圖1 小鼠腸道菌群ERIC-PCR圖譜Fig.1 ERIC-PCR profiles of intestinal microflora in mice

正常對(duì)照組（N）條帶較多，以小片段居多，3條主要條帶集中在360、430 bp和610 bp附近。急性酒精性肝損傷組（A）以360 bp的條帶為優(yōu)勢(shì)條帶，而610 bp左右的條帶強(qiáng)度減弱。與正常對(duì)照組相比，大蒜多糖和護(hù)肝片給藥組（GpH，GpL，P），小鼠腸道中條帶數(shù)量基本不變，但是320 bp左右的條帶強(qiáng)度明顯增大，610 bp左右的條帶強(qiáng)度有減小的趨勢(shì)。與急性肝損傷組相比，大蒜多糖和護(hù)肝片給藥組（GpH，GpL，P）小鼠腸道中360 bp左右的條帶強(qiáng)度明顯減小。以上研究結(jié)果表明酒精建立急性肝損傷模型小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，320、360 bp和610 bp左右的條帶為大蒜多糖預(yù)防給藥組、護(hù)肝片組和急性酒精性肝損傷組小鼠腸道中的特征條帶。

2.2 PCR-DGGE圖譜分析

大蒜多糖對(duì)小鼠預(yù)防給藥30天后使用紅星二鍋頭建立酒精性肝損傷小鼠模型，腸道菌群DGGE圖譜如圖2所示。

圖2 小鼠腸道菌群DGGE圖譜和UPGMA相似性聚類分析Fig.2 Representative DGGE profiles（A）and UPGMA dendrograms（B）of intestinal microflora

同一位置的條帶代表相同的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，條帶亮度則反映出這一細(xì)菌的相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)組各泳道條帶較多，亮度較強(qiáng)，表明小鼠腸道菌群的種類和數(shù)量較多，腸道菌群結(jié)構(gòu)的豐富度和多樣性較高。條帶a、b、c、e存在于各組樣品中為共有條帶，說明其所代表的細(xì)菌是小鼠腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群，其中條帶a所代表的細(xì)菌在正常對(duì)照組和大蒜多糖高劑量組中含量最大。條帶d在GpH泳道中強(qiáng)度高，含量大，而在其他實(shí)驗(yàn)組中含量明顯降低，這表明d所代表的細(xì)菌是大蒜多糖高劑量組小鼠與其他組小鼠腸道差異菌群。UPGMA分析DGGE圖的相似性，結(jié)果顯示各組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)聚成兩大簇，急性酒精性肝損傷組（A）單獨(dú)聚成一簇，其他組聚成另一簇，兩大簇之間相似性較低，僅為0.62，表明酒精導(dǎo)致急性肝損傷的同時(shí)對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)造成影響。正常對(duì)照組（N）和大蒜多糖高劑量組（GpH）小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的相似性較高，為0.81，護(hù)肝片組（P）小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與上述兩組也具有較高的相似性，為0.75，這說明護(hù)肝片和高劑量大蒜多糖對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響相似。

2.3 不同給藥組小鼠腸道菌群多樣性分析

大蒜多糖預(yù)防給藥小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性分析如表1所示。

Shannon-Weaver多樣性指數(shù)（H’）比較不同給藥組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性差異，H’指數(shù)越大，群落所含的信息量也就越大，均勻度Evenness（E）指數(shù)分析菌群分布情況。H’和E由以下公式獲得：H’=-∑（pi）（lnpi），E=H’/lnS，pi=ni/∑ni，ni是條帶灰度值[11]，pi為第i條帶的灰度值與該泳道所有條帶灰度值總和的比值，S為條帶數(shù)，H’為多樣性指數(shù)，E為均勻度指數(shù)。與正常對(duì)照組相比，急性酒精性肝損傷組小鼠腸道菌群條帶數(shù)目增多，豐富度指數(shù)S顯著增大（P＜0.01），推測(cè)酒精攝入導(dǎo)致腸道內(nèi)某種細(xì)菌增多。急性酒精性肝損傷組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性指數(shù)H’和均勻度指數(shù)E與正常對(duì)照組相比顯著減?。≒＜0.01），正常對(duì)照組、護(hù)肝片組和大蒜多糖高低劑量組菌群結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)H’和均勻度指數(shù)E與急性酒精性肝損傷組相比顯著增大（P＜0.05），以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酒精的攝入對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)有明顯影響，導(dǎo)致菌群多樣性降低，菌群失調(diào)。其中，大蒜多糖高劑量組的多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)最高，其DGGE圖譜所反映的信息量最大。

表1 不同給藥組小鼠腸道菌群多樣性分析（±SD，n=8）Table 1 Microflora diversity indexes analysis of different groups（±SD，n=8）

表1 不同給藥組小鼠腸道菌群多樣性分析（±SD，n=8）Table 1 Microflora diversity indexes analysis of different groups（±SD，n=8）

注：與急性酒精性肝損傷組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)相比，*P＜0.05顯著性差異，**P＜0.01極顯著性差異，與正常對(duì)照組相比較，##P＜0.01極顯著性差異。

組別 S值 H’值 E值正常對(duì)照組 10.75±0.96* 2.247 1±0.033 4* 0.946 1±0.024 1**急性酒精性肝損傷組 13.25±1.50# 1.812 8±0.139 4## 0.70 5±0.010 1##護(hù)肝片組 12.75±1.50 2.364 5±0.072 4* 0.928 7±0.023 1**大蒜多糖高濃度組 12.50±0.58 2.594 3±0.013 2** 1.027 0±0.020 7**大蒜多糖低濃度組 11.75±0.96* 2.213 1±0.040 1* 0.898 2±0.011 2*

2.4 差異條帶序列分析

DGGE圖譜優(yōu)勢(shì)條帶測(cè)序結(jié)果在GenBank中用Blast進(jìn)行檢索和同源性比較，如表2所示。糞便細(xì)菌與數(shù)據(jù)庫已知細(xì)菌序列的相似性均在93%以上。

由表2可知，菌a和Eubacterium plexicaudatum的相似性為94%，為優(yōu)桿菌屬（Eubacterium）細(xì)菌；菌b與維氏氣單胞菌的相似性為93%；菌c與梭菌屬的相似性為97%；菌d與Lactobacillus equicursoris的相似性為96%，為乳酸菌屬（Lactobacillus）；菌e與Enterococcus sulfureus的相似性為97%。以上研究結(jié)果可知，急性酒精性肝損傷的小鼠腸道菌群失調(diào)，糞便標(biāo)本中優(yōu)桿菌屬和乳酸菌屬細(xì)菌明顯減少，而高劑量的大蒜多糖組，優(yōu)桿菌屬和乳酸菌屬含量均增大。

表2 DGGE圖譜中優(yōu)勢(shì)條帶測(cè)序與參比序列對(duì)照結(jié)果Table 2 Comparative results of dominant band sequence and reference sequence in DGGE profile

3 結(jié)論與討論

ERIC-PCR圖譜表明正常對(duì)照小鼠腸道中菌群條帶主要集中在360、430 bp和610 bp附近。急性酒精性肝損傷組小鼠腸道中以360 bp的條帶為優(yōu)勢(shì)條帶，而610 bp左右的條帶強(qiáng)度減弱，大蒜多糖和陽性藥護(hù)肝片組320 bp左右的條帶強(qiáng)度均有明顯增大，360 bp左右的條帶強(qiáng)度減小。因此，推測(cè)320、360 bp和610 bp左右的條帶為急性酒精性肝損傷組和大蒜多糖干預(yù)組小鼠腸道中的特征條帶。320 bp和360 bp等特征條帶的確定，可作為后續(xù)篩選治療酒精性肝損傷藥物的切入點(diǎn)。ERIC-PCR技術(shù)可以快速、靈敏地從分子水平比較分析微生物群落的結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)調(diào)節(jié)腸道菌群藥物的篩選，可是因?yàn)槠渫ㄟ^DNA分子量來分離目標(biāo)條帶，可能相同條帶包括多種細(xì)菌，ERIC-PCR只能簡單判斷樣品中微生物的分布趨勢(shì)。為明確腸道菌群優(yōu)勢(shì)條帶的序列及菌群結(jié)構(gòu)的整體差異，基于16S rRNA基因的PCR-DGGE技術(shù)被應(yīng)用于研究大蒜多糖對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠腸道菌群失調(diào)的影響，為開發(fā)利用大蒜多糖的生物活性提供一個(gè)新方向。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大蒜多糖預(yù)防給藥能夠增加腸道中優(yōu)桿菌屬和乳酸菌屬細(xì)菌的數(shù)量，腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性和均勻度指數(shù)均增大。優(yōu)桿菌是人和動(dòng)物口腔與腸道正常菌群的成員，對(duì)機(jī)體有營養(yǎng)生物拮抗和維持腸道微生物生態(tài)學(xué)平衡等功能[12]。乳酸桿菌也是人體腸道中正常的優(yōu)勢(shì)菌群，黏附于腸上皮細(xì)胞表面，在維持人體腸道微生態(tài)平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降解有毒物質(zhì)、激活免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮著重要作用，且能夠促進(jìn)宿主的消化、吸收和腸胃功能[13]。大蒜多糖促進(jìn)這兩種腸道有益細(xì)菌的生長，對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)具有很好的保護(hù)作用。

綜上，由于“腸——肝”軸的存在，腸道菌群在肝損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，很多改善肝臟功能的天然產(chǎn)物都具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的作用。本研究利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技術(shù)分析大蒜多糖對(duì)酒精性肝損傷小鼠腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)急性酒精性肝損傷小鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，大蒜多糖預(yù)防給藥能夠增加小鼠腸道中優(yōu)桿菌屬和乳酸菌屬等益生菌數(shù)量，對(duì)急性酒精性肝損傷伴有的腸道菌群失調(diào)具有一定的預(yù)防作用。本課題為大蒜多糖預(yù)防酒精性肝損傷伴有的腸道菌群失調(diào)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為深入研究腸道菌群在酒精性肝損傷發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)，為以腸道菌群作為篩選治療酒精性肝病藥物的新靶點(diǎn)提供思路與途徑。