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        大蒜多糖對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠腸道菌群失調(diào)的影響

        2018-11-09 05:37:34范穎趙鑫李娜吳曼曼李新莉
        食品研究與開發(fā) 2018年22期
        關(guān)鍵詞:小鼠

        范穎,趙鑫,李娜,吳曼曼,李新莉,*

        (1.大連醫(yī)科大學(xué)臨床技能中心,遼寧大連116044;2.大連醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)系,遼寧大連116044)

        酒精性肝損傷是酒精攝入過量(急性)或長期酗酒(慢性)導(dǎo)致的中毒性肝病[1],影響著全世界數(shù)百萬人口,是導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率的主要原因[2]。肝臟與腸道之間存在“腸——肝”軸[3],在肝損傷的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究中,腸道菌群發(fā)揮著重要作用,腸道與肝損傷之間的相互促進(jìn)相互影響的關(guān)系也逐漸被闡明。如腸道菌群參與酒精的代謝,將乙醇轉(zhuǎn)化為有毒性的、高濃度的乙醛,導(dǎo)致腸道的通透性增加,打破了腸道菌群的平衡,革蘭陰性菌過度生長,產(chǎn)生的內(nèi)毒素誘導(dǎo)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α),激活誘導(dǎo)型一氧化氮合酶系統(tǒng)(inducible nitric oxide synthase system,iNOS),加重了腸道的炎癥反應(yīng),而NO的大量合成又促進(jìn)了肝臟的氧化應(yīng)激反應(yīng),造成肝臟的進(jìn)一步損傷[4]。過量飲酒導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào),成為酒精性肝病的潛在發(fā)病機(jī)制,而腸道菌群失調(diào)造成內(nèi)毒素升高也是造成肝臟損傷的重要發(fā)病原因。蔡夏夏等[5]研究表明酒精性肝損傷動(dòng)物腸道菌群改變,出現(xiàn)肝臟脂肪變性及腸道上皮細(xì)胞屏障功能障礙等,通過補(bǔ)充天然活性成分能夠刺激雙歧桿菌等益生菌的生長,具有益生元的作用。Chen等[6]發(fā)現(xiàn)肝損傷患者服用乳糖醇可以增加乳酸桿菌和雙歧桿菌,抑制條件致病菌的生長而減少內(nèi)毒素的產(chǎn)生。因此益生菌和益生元具有減輕肝臟的損傷,改善肝臟功能的作用。

        大蒜(Allium Sativum L.)為百合科蔥屬植物的鱗莖,是生活中常用的香辛料和調(diào)味品,其主要活性成分為大蒜素和大蒜多糖(garlic polysaccharide,Gp)。大蒜素具有抗菌、調(diào)血脂、降血糖、抗腫瘤、抗衰老等功能[7],且對(duì)酒精性肝損傷具有保護(hù)作用[8]。大蒜多糖來源于大蒜素提取之后的殘?jiān)?,具有抗病毒、抗氧化、護(hù)肝、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長等作用[9]。

        人體腸道細(xì)菌以厭氧菌為主,傳統(tǒng)的微生物技術(shù)僅能反映腸道菌群數(shù)目變化這一指標(biāo),更有超過70%的腸道菌群無法通過傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定,不能反映腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性和種群變化,因此,腸桿菌基因間重復(fù)共有序列基因擴(kuò)增(enter obacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)——變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)等分子生物學(xué)方法被廣泛用于菌群結(jié)構(gòu)及種群變化,具有靈敏度高、可重復(fù)性、可靠性好,省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)。

        用大蒜多糖對(duì)小鼠預(yù)防給藥30 d,使用56°紅星二鍋頭灌胃小鼠建立急性酒精性肝損傷模型,ERICPCR和PCR-DGGE技術(shù)研究大蒜多糖對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠腸道菌群的影響,分析腸道菌群結(jié)構(gòu)的相似性和多樣性,鑒定優(yōu)勢(shì)菌屬序列。以腸道菌群作為治療酒精性肝病的潛在作用靶點(diǎn),初步探討大蒜多糖預(yù)防酒精性肝損傷的可能作用機(jī)制,為進(jìn)一步開發(fā)保肝護(hù)肝藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        新鮮大蒜:市售;護(hù)肝片:長春海外制藥集團(tuán)有限公司,批號(hào):Z22020994,規(guī)格:0.35g;北京 56°紅星二鍋頭:北京紅星股份有限公司;糞便細(xì)菌DNA提取試劑盒:成都福際生物技術(shù)有限公司;GC-341f(5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG)、518r(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG)、ERIC-1(ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC)、ERIC-2(AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG):英濰捷基上海貿(mào)易有限公司;PCR-Mix:大連優(yōu)萌威貿(mào)易有限公司;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、去離子甲酰胺、瓊脂糖、溴化乙錠(EB):大連羽銘生物科技有限公司;DL2000 Marker、DL100 Marker:大連寶生物工程有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        UVS-1渦旋振蕩器:北京優(yōu)晟科技有限公司;HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(離心半徑6 cm):安徽中科中佳科學(xué)有限公司;JY-spat瓊脂糖水平電泳儀、DGGE電泳儀:大連競邁設(shè)備有限公司。

        1.3 大蒜多糖的制備

        200 g新鮮大蒜提取大蒜素后的殘?jiān)?,按料液? ∶4(g/mL)加入水 800 mL,80℃水浴 2 h,雙層紗布過濾,濾液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至300 mL,加入無水乙醇使其終濃度為70%,4℃過夜,5 000 r/min離心15 min得到白色沉淀,冷凍干燥即得大蒜多糖(Gp)。

        1.4 模型建立與分組

        SPF級(jí)KM小鼠,雌雄各半,體重18 g~22 g,由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(遼)2013-0002,本實(shí)驗(yàn)通過大連醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)同意。護(hù)肝片和大蒜多糖分別溶于生理鹽水配成護(hù)肝片溶液(6 mg/mL)、大蒜多糖高濃度(25 mg/mL)和低濃度(15 mg/mL)溶液[10]。小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(N)、急性肝損傷組(A)、護(hù)肝片組(P)、大蒜多糖高(GpH)、低濃度組(GpL),每組8只。除N組和A組,其余各組灌服0.2 mL相應(yīng)藥物30 d,末次給藥30分鐘后,正常對(duì)照組灌服生理鹽水,其他組灌胃14 mL/kg紅星二鍋頭建立急性酒精性肝損傷模型,12小時(shí)后取每只小鼠糞便,于80℃保存。

        1.5 糞便細(xì)菌DNA提取

        使用試劑盒提取每只小鼠糞便細(xì)菌DNA,按說明書進(jìn)行操作。

        1.6 ERIC-PCR擴(kuò)增

        使用ERIC-PCR上、下游引物ERIC-1和ERIC-2,擴(kuò)增體系(25μL)為:2×EasyTaqPCRSuperMix 12.5 μL,10 μmol/L 的上下游引物各 0.5 μL,DNA 模板 2 μL,去離子水補(bǔ)充至25 μL。PCR程序:預(yù)變性94℃5 min;變性94℃50 s,退火49℃ 30 s,46℃ 30 s,延伸72℃3 min,35個(gè)循環(huán);充分延伸72℃9 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)品用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),以2 000 bp Marker為參照。

        1.7PCR-DGGE電泳

        使用16S rRNA基因V3可變區(qū)上、下游引物GC-341f和518r,擴(kuò)增體系同1.5。PCR程序:預(yù)變性94℃5 min;變性 94 ℃ 30 s,退火 54 ℃ 30 s,延伸 72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán);充分延伸72℃7 min。采用8%丙烯酰胺凝膠配制25%~50%DGGE變性梯度凝膠 [其中100%濃度變性梯度凝膠含40%(體積分?jǐn)?shù))去離子甲酰胺和7 mol/L尿素],取10 μL PCR產(chǎn)物于DGGE膠,60℃、70 V電泳5 h,電泳后取出凝膠使用0.125‰EB染色,拍照。

        1.8 差別條帶序列分析

        切下PCR-DGGE圖譜中的優(yōu)勢(shì)條帶,加入20 μL無菌水搗碎,于95℃浸泡10 min,37℃過夜,取上清液做模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物為341f和518r,PCR反應(yīng)體系和程序同1.6。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序,結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast對(duì)比分析。

        1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        采用Quantity One 4.6.2軟件分析ERIC-PCR圖譜中主要條帶的分子量,對(duì)PCR-DGGE圖譜進(jìn)行UPGMA相似性聚類分析和多樣性分析,所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 10.0軟件包處理,正態(tài)計(jì)量指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);P值<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 EIRC-PCR圖譜分析

        大蒜多糖對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)防給藥30天后建立急性酒精性肝損傷模型,腸道菌群ERIC-PCR指紋圖譜如圖1所示。

        圖1 小鼠腸道菌群ERIC-PCR圖譜Fig.1 ERIC-PCR profiles of intestinal microflora in mice

        正常對(duì)照組(N)條帶較多,以小片段居多,3條主要條帶集中在360、430 bp和610 bp附近。急性酒精性肝損傷組(A)以360 bp的條帶為優(yōu)勢(shì)條帶,而610 bp左右的條帶強(qiáng)度減弱。與正常對(duì)照組相比,大蒜多糖和護(hù)肝片給藥組(GpH,GpL,P),小鼠腸道中條帶數(shù)量基本不變,但是320 bp左右的條帶強(qiáng)度明顯增大,610 bp左右的條帶強(qiáng)度有減小的趨勢(shì)。與急性肝損傷組相比,大蒜多糖和護(hù)肝片給藥組(GpH,GpL,P)小鼠腸道中360 bp左右的條帶強(qiáng)度明顯減小。以上研究結(jié)果表明酒精建立急性肝損傷模型小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變,320、360 bp和610 bp左右的條帶為大蒜多糖預(yù)防給藥組、護(hù)肝片組和急性酒精性肝損傷組小鼠腸道中的特征條帶。

        2.2 PCR-DGGE圖譜分析

        大蒜多糖對(duì)小鼠預(yù)防給藥30天后使用紅星二鍋頭建立酒精性肝損傷小鼠模型,腸道菌群DGGE圖譜如圖2所示。

        圖2 小鼠腸道菌群DGGE圖譜和UPGMA相似性聚類分析Fig.2 Representative DGGE profiles(A)and UPGMA dendrograms(B)of intestinal microflora

        同一位置的條帶代表相同的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌,條帶亮度則反映出這一細(xì)菌的相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)組各泳道條帶較多,亮度較強(qiáng),表明小鼠腸道菌群的種類和數(shù)量較多,腸道菌群結(jié)構(gòu)的豐富度和多樣性較高。條帶a、b、c、e存在于各組樣品中為共有條帶,說明其所代表的細(xì)菌是小鼠腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群,其中條帶a所代表的細(xì)菌在正常對(duì)照組和大蒜多糖高劑量組中含量最大。條帶d在GpH泳道中強(qiáng)度高,含量大,而在其他實(shí)驗(yàn)組中含量明顯降低,這表明d所代表的細(xì)菌是大蒜多糖高劑量組小鼠與其他組小鼠腸道差異菌群。UPGMA分析DGGE圖的相似性,結(jié)果顯示各組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)聚成兩大簇,急性酒精性肝損傷組(A)單獨(dú)聚成一簇,其他組聚成另一簇,兩大簇之間相似性較低,僅為0.62,表明酒精導(dǎo)致急性肝損傷的同時(shí)對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)造成影響。正常對(duì)照組(N)和大蒜多糖高劑量組(GpH)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的相似性較高,為0.81,護(hù)肝片組(P)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與上述兩組也具有較高的相似性,為0.75,這說明護(hù)肝片和高劑量大蒜多糖對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響相似。

        2.3 不同給藥組小鼠腸道菌群多樣性分析

        大蒜多糖預(yù)防給藥小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性分析如表1所示。

        Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(H’)比較不同給藥組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性差異,H’指數(shù)越大,群落所含的信息量也就越大,均勻度Evenness(E)指數(shù)分析菌群分布情況。H’和E由以下公式獲得:H’=-∑(pi)(lnpi),E=H’/lnS,pi=ni/∑ni,ni是條帶灰度值[11],pi為第i條帶的灰度值與該泳道所有條帶灰度值總和的比值,S為條帶數(shù),H’為多樣性指數(shù),E為均勻度指數(shù)。與正常對(duì)照組相比,急性酒精性肝損傷組小鼠腸道菌群條帶數(shù)目增多,豐富度指數(shù)S顯著增大(P<0.01),推測(cè)酒精攝入導(dǎo)致腸道內(nèi)某種細(xì)菌增多。急性酒精性肝損傷組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性指數(shù)H’和均勻度指數(shù)E與正常對(duì)照組相比顯著減?。≒<0.01),正常對(duì)照組、護(hù)肝片組和大蒜多糖高低劑量組菌群結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)H’和均勻度指數(shù)E與急性酒精性肝損傷組相比顯著增大(P<0.05),以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,酒精的攝入對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)有明顯影響,導(dǎo)致菌群多樣性降低,菌群失調(diào)。其中,大蒜多糖高劑量組的多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)最高,其DGGE圖譜所反映的信息量最大。

        表1 不同給藥組小鼠腸道菌群多樣性分析(±SD,n=8)Table 1 Microflora diversity indexes analysis of different groups(±SD,n=8)

        表1 不同給藥組小鼠腸道菌群多樣性分析(±SD,n=8)Table 1 Microflora diversity indexes analysis of different groups(±SD,n=8)

        注:與急性酒精性肝損傷組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)相比,*P<0.05顯著性差異,**P<0.01極顯著性差異,與正常對(duì)照組相比較,##P<0.01極顯著性差異。

        組別 S值 H’值 E值正常對(duì)照組 10.75±0.96* 2.247 1±0.033 4* 0.946 1±0.024 1**急性酒精性肝損傷組 13.25±1.50# 1.812 8±0.139 4## 0.70 5±0.010 1##護(hù)肝片組 12.75±1.50 2.364 5±0.072 4* 0.928 7±0.023 1**大蒜多糖高濃度組 12.50±0.58 2.594 3±0.013 2** 1.027 0±0.020 7**大蒜多糖低濃度組 11.75±0.96* 2.213 1±0.040 1* 0.898 2±0.011 2*

        2.4 差異條帶序列分析

        DGGE圖譜優(yōu)勢(shì)條帶測(cè)序結(jié)果在GenBank中用Blast進(jìn)行檢索和同源性比較,如表2所示。糞便細(xì)菌與數(shù)據(jù)庫已知細(xì)菌序列的相似性均在93%以上。

        由表2可知,菌a和Eubacterium plexicaudatum的相似性為94%,為優(yōu)桿菌屬(Eubacterium)細(xì)菌;菌b與維氏氣單胞菌的相似性為93%;菌c與梭菌屬的相似性為97%;菌d與Lactobacillus equicursoris的相似性為96%,為乳酸菌屬(Lactobacillus);菌e與Enterococcus sulfureus的相似性為97%。以上研究結(jié)果可知,急性酒精性肝損傷的小鼠腸道菌群失調(diào),糞便標(biāo)本中優(yōu)桿菌屬和乳酸菌屬細(xì)菌明顯減少,而高劑量的大蒜多糖組,優(yōu)桿菌屬和乳酸菌屬含量均增大。

        表2 DGGE圖譜中優(yōu)勢(shì)條帶測(cè)序與參比序列對(duì)照結(jié)果Table 2 Comparative results of dominant band sequence and reference sequence in DGGE profile

        3 結(jié)論與討論

        ERIC-PCR圖譜表明正常對(duì)照小鼠腸道中菌群條帶主要集中在360、430 bp和610 bp附近。急性酒精性肝損傷組小鼠腸道中以360 bp的條帶為優(yōu)勢(shì)條帶,而610 bp左右的條帶強(qiáng)度減弱,大蒜多糖和陽性藥護(hù)肝片組320 bp左右的條帶強(qiáng)度均有明顯增大,360 bp左右的條帶強(qiáng)度減小。因此,推測(cè)320、360 bp和610 bp左右的條帶為急性酒精性肝損傷組和大蒜多糖干預(yù)組小鼠腸道中的特征條帶。320 bp和360 bp等特征條帶的確定,可作為后續(xù)篩選治療酒精性肝損傷藥物的切入點(diǎn)。ERIC-PCR技術(shù)可以快速、靈敏地從分子水平比較分析微生物群落的結(jié)構(gòu),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)調(diào)節(jié)腸道菌群藥物的篩選,可是因?yàn)槠渫ㄟ^DNA分子量來分離目標(biāo)條帶,可能相同條帶包括多種細(xì)菌,ERIC-PCR只能簡單判斷樣品中微生物的分布趨勢(shì)。為明確腸道菌群優(yōu)勢(shì)條帶的序列及菌群結(jié)構(gòu)的整體差異,基于16S rRNA基因的PCR-DGGE技術(shù)被應(yīng)用于研究大蒜多糖對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠腸道菌群失調(diào)的影響,為開發(fā)利用大蒜多糖的生物活性提供一個(gè)新方向。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大蒜多糖預(yù)防給藥能夠增加腸道中優(yōu)桿菌屬和乳酸菌屬細(xì)菌的數(shù)量,腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性和均勻度指數(shù)均增大。優(yōu)桿菌是人和動(dòng)物口腔與腸道正常菌群的成員,對(duì)機(jī)體有營養(yǎng)生物拮抗和維持腸道微生物生態(tài)學(xué)平衡等功能[12]。乳酸桿菌也是人體腸道中正常的優(yōu)勢(shì)菌群,黏附于腸上皮細(xì)胞表面,在維持人體腸道微生態(tài)平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降解有毒物質(zhì)、激活免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮著重要作用,且能夠促進(jìn)宿主的消化、吸收和腸胃功能[13]。大蒜多糖促進(jìn)這兩種腸道有益細(xì)菌的生長,對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)具有很好的保護(hù)作用。

        綜上,由于“腸——肝”軸的存在,腸道菌群在肝損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,很多改善肝臟功能的天然產(chǎn)物都具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的作用。本研究利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技術(shù)分析大蒜多糖對(duì)酒精性肝損傷小鼠腸道菌群的影響,發(fā)現(xiàn)急性酒精性肝損傷小鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,大蒜多糖預(yù)防給藥能夠增加小鼠腸道中優(yōu)桿菌屬和乳酸菌屬等益生菌數(shù)量,對(duì)急性酒精性肝損傷伴有的腸道菌群失調(diào)具有一定的預(yù)防作用。本課題為大蒜多糖預(yù)防酒精性肝損傷伴有的腸道菌群失調(diào)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為深入研究腸道菌群在酒精性肝損傷發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ),為以腸道菌群作為篩選治療酒精性肝病藥物的新靶點(diǎn)提供思路與途徑。

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