劉玲，張鴻飛，張嵐，秦酈，王德培，3，*

（1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；3.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

黑曲霉（Aspergillus niger）作為一種重要的工業(yè)生產(chǎn)安全菌株之一，可用于有機(jī)酸、淀粉酶、酸性蛋白酶等的工業(yè)生產(chǎn)中。同時(shí)也被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥，飼料生產(chǎn)，食品加工，廢料處理等領(lǐng)域[1]。因此進(jìn)一步從分子方面深入研究工業(yè)菌株黑曲霉的代謝機(jī)理，可以從微觀的角度調(diào)控基因的表達(dá)，為獲得高產(chǎn)工業(yè)黑曲霉菌株奠定了理論基礎(chǔ)。目前，基因敲除是研究基因功能最為便捷準(zhǔn)確的分子生物學(xué)改造手段之一，主要應(yīng)用于對(duì)已知DNA序列的基因功能和基因調(diào)控機(jī)理研究。基因敲除以基因同源重組技術(shù)為基礎(chǔ)，通過構(gòu)建帶有同源重組的DNA片段的基因敲除載體，將其轉(zhuǎn)化入目的細(xì)胞中，部分或者完全取代原始基因組中的等位基因，通過對(duì)突變體表型的分析從而反向研究基因功能的方法[2]。

工業(yè)黑曲霉基因敲除體系依賴于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑曲霉轉(zhuǎn)化體系（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT），該轉(zhuǎn)化體系的條件優(yōu)化已經(jīng)完成，大大減少了絲狀真菌的轉(zhuǎn)化操作，提高了載體上的同源DNA片段的插入效率[3]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法雖然能大幅度地提高同源重組片段的轉(zhuǎn)化效率，但是由于T-DNA自身會(huì)隨機(jī)整合到基因組中，攜帶同樣的抗性標(biāo)記造成假陽性率高，從而使篩選同源雙交換產(chǎn)生的基因敲除陽性轉(zhuǎn)化子工作的難度增大。另一方面，等位基因同源重組的效率相對(duì)T-DNA隨機(jī)插入的效率低很多，造成基因敲除陽性轉(zhuǎn)化子的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于隨機(jī)插入的轉(zhuǎn)化子的數(shù)量，因此需要篩選大量轉(zhuǎn)化子才能得到正確的基因敲除轉(zhuǎn)化子。單純皰疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus thymidine kinase，HSVtk）可在絲狀真菌中表達(dá)，將培養(yǎng)基中的特定化合物5-氟脫氧尿苷（5-fluoro-2'-deoxyuridine，F(xiàn)2dU）轉(zhuǎn)變?yōu)檎婢亩拘晕镔|(zhì)，導(dǎo)致真菌致死[4]，因此，可在TDNA的同源重組DNA片段上游插入致死基因HSVtk基因序列，從而減少黑曲霉假陽性轉(zhuǎn)化子，提高正確基因敲除菌株的比例，從而提高篩選效率。

海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子以1，1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性二糖，其代謝的前體物質(zhì)為6-磷酸海藻糖。6-磷酸海藻糖主要是由尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖經(jīng)海藻糖6-磷酸合成酶催化合成6-磷酸海藻糖。6-磷酸海藻糖是6-磷酸葡萄糖分支代謝流的重要物質(zhì)，顯著影響6-磷酸葡萄糖合成檸檬酸的轉(zhuǎn)化效率，因此敲除海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，tpsA），可以調(diào)控碳源在主代謝流的積累量，從而提高黑曲霉的檸檬酸產(chǎn)量。本文首先構(gòu)建具有致死基因HSVtk的工程菌株，獲得致死篩選濃度為10 μmol/L 5-氟脫氧尿苷，然后構(gòu)建具有單純皰疹病毒胸苷激酶和潮霉素雙標(biāo)記以敲除tpsA質(zhì)粒，通過反向篩選，減少假陽性率，高效獲得tpsA同源重組敲除菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株，質(zhì)粒和引物

試驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒見表1。試驗(yàn)中用到的引物見表2。

表1 試驗(yàn)所用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in test

表2 試驗(yàn)中用到引物Table 2 The primers used in test

續(xù)表2 試驗(yàn)中用到引物Continue table 2 The primers used in test

1.1.2 培養(yǎng)基

肉湯（Luria-Bertani，LB）培養(yǎng)基用于大腸桿菌和農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)，完全培養(yǎng)基（complete medium，CM）和馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基用于黑曲霉的培養(yǎng)，配制方法參照文獻(xiàn)[5]。誘導(dǎo)培養(yǎng)基（induction medium，IM），農(nóng)桿菌侵染所需培養(yǎng)基及試劑參考文獻(xiàn)[6]配制。

1.2 試劑與溶液的配制

Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、Prime STAR HS DNA聚合酶（2.5 U/μL）、RNaseA（5 mg/mL）、T4 DNA 連接酶（10 U/μL）、DL5000 DNA Maker、DL10000 DNA Maker、限制性內(nèi)切酶 EcoRI（15 U/μL）、SalI（15 U/μL）、KpnI（10 U/μL）：TaKaRa公司；5-氟脫氧尿苷、潮霉素 B、乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）：Solarbio公司；其他試劑：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。

潮霉素B（hygromycin）：潮霉素B 100 mg，ddH2O定容至1 mL。母液濃度為100 mg/mL，工作濃度為200 μg/mL。

1.3 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑曲霉轉(zhuǎn)化體系

將實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒p80-HSVtk通過電轉(zhuǎn)化的方法，導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens（AGL1）中，再利用農(nóng)桿菌AGL1介導(dǎo)侵染黑曲霉，完成黑曲霉的遺傳轉(zhuǎn)化，具體操作方法參見曹張磊等[3]的方法進(jìn)行。

1.4 黑曲霉對(duì)F2dU的敏感性實(shí)驗(yàn)

為確定黑曲霉是否適用于5-氟脫氧尿苷參與下的反向篩選體系，進(jìn)行黑曲霉對(duì)F2dU的敏感性實(shí)驗(yàn)。將質(zhì)粒p80-HSVtk電轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌AGL1中，使用攜帶質(zhì)粒p80-HSVtk的農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染原始菌株黑曲霉10142，從而獲得一株含有致死基因HSVtk的隨機(jī)插入黑曲霉轉(zhuǎn)化子7-1。取200 μL濃度均為1.3×106個(gè)/mL的突變株7-1和原始菌株的孢子懸液分別涂布于 F2dU 終濃度為 0、10、25、50、150、300 μmol/L的CM培養(yǎng)基中，35℃靜置培養(yǎng)5 d，觀察結(jié)果。

1.5 敲除質(zhì)粒p81的構(gòu)建

海藻糖-6-磷酸合成酶（tpsA）基因的同源重組敲除片段的構(gòu)建使用了融合PCR的方法，將同源重組左右臂，潮霉素抗性標(biāo)記以及致死基因用常規(guī)PCR分別擴(kuò)增后，融合成為tpsA基因敲除框，酶切連接完成p81質(zhì)粒的構(gòu)建。首先以p44質(zhì)粒為模板，以HYG-F/HYG-R為引物（本文所用引物堿基序列見表2），常規(guī)PCR反應(yīng)擴(kuò)增1.4 kb的潮霉素抗性片段。同時(shí)以pBHt2-tk質(zhì)粒為模板，以HSVtk-F/HSVtk-R為上下游引物，PCR擴(kuò)增1.8 kb的HSVtk基因片段。以黑曲霉基因組為模板，以1F/1R和2F/2R為引物，PCR擴(kuò)增長度均為1 kb左右的tpsA基因同源重組左右臂片段。其中引物1F的5’端含有與HSVtk-R互為反向互補(bǔ)的接頭序列，引物2F的5’端含有與HYG-R互為反向互補(bǔ)的接頭序列。從而獲得末端含有相應(yīng)互為反向互補(bǔ)序列的4個(gè)PCR產(chǎn)物。使用融合PCR的方法擴(kuò)增2.8 kb的HSVtk和同源左臂的融合片段，使用限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRI雙酶切連接的方法將此片段連接到質(zhì)粒p40中。同樣的方法，使用限制性內(nèi)切酶KpnI和SalI將HYG和同源右臂的融合片段雙酶切連接到過程質(zhì)粒p40-HSVtk-L中。從而完成敲除質(zhì)粒p81的構(gòu)建。

1.6 tpsA基因敲除陽性菌株的篩選驗(yàn)證

將農(nóng)桿菌AGL1介導(dǎo)侵染黑曲霉后的孢子，涂布于濃度為200 mg/mL的潮霉素B的抗性平板上，待長出單菌落點(diǎn)接到10 μmol/L濃度的F2dU平板中，35℃培養(yǎng)5天后，挑出能正常生長菌株即可能的同源重組陽性轉(zhuǎn)化子，提取基因組并利用PCR的方法進(jìn)行分子生物學(xué)驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

2.1 F2dU的篩選濃度的確定

為了確定F2dU的篩選濃度，必須獲得一株含有HSVtk基因的黑曲霉隨機(jī)插入轉(zhuǎn)化子。將質(zhì)粒p80-HSVtk電轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌AGL1中，使用攜帶質(zhì)粒p80-HSVtk的農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染原始菌株黑曲霉10142，通過潮霉素抗性篩選獲得一株含有致死基因HSVtk的隨機(jī)插入黑曲霉轉(zhuǎn)化子7-1。在F2dU終濃度分別為0、10、25、50、150、300 μmol/L 的 CM 平板上，觀察突變株7-1和原始菌株對(duì)F2dU的敏感性。觀察結(jié)果如圖1所示。

含有HSVtk基因的黑曲霉轉(zhuǎn)化子在濃度為10 μmol/L的F2dU的CM平板上，孢子完全無法萌發(fā)。因此選用10 μmol/L的F2dU當(dāng)作轉(zhuǎn)化子的篩選濃度即可抑制含HSVtk的T-DNA隨機(jī)插入轉(zhuǎn)化子的生長，從而大大減少篩選操作，提高陽性轉(zhuǎn)化子的比例。同時(shí)原始菌株在含有10 μmol/L F2dU的CM平板上生長并不受到影響。證明該反向篩選方法可減少隨機(jī)插入轉(zhuǎn)化子的概率，提高黑曲霉原位同源重組轉(zhuǎn)化子的篩選效率。

圖1 黑曲霉7-1和原始菌株在含有不同濃度F2dU的CM培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d的生長情況Fig.1 The growth of 7-1 and A.niger 10142 on CM plates with the different F2dU concentrations after 3 d

2.2 tpsA基因敲除質(zhì)粒的成功構(gòu)建

通過常規(guī)PCR反應(yīng)，得到長度分別為1.8、1.0、1.4、1.0 kb的HSVtk基因片段，同源重組左臂片段，HYG基因片段和同源重組右臂片段。利用融合PCR，將HSVtk基因和同源左臂這2個(gè)DNA片段末端反向互補(bǔ)序列相互結(jié)合，構(gòu)建2.8 kb的HSVtk和同源左臂的融合片段，同樣的方法，得到2.4 kb的HYG和同源右臂的融合片段。先通過KpnI和EcoRI處理質(zhì)粒p40和2.8 kb的融合片段，再過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性轉(zhuǎn)化子后得到過程質(zhì)粒p40-HSVtk-L。再使用同樣的方法，使用KpnI和SalI將2.4 kb的融合片段連接到過程質(zhì)粒p40-HSVtk-L中，完成敲除質(zhì)粒p81的構(gòu)建，見圖2。

圖2 tpsA基因敲除質(zhì)粒p81構(gòu)建Fig.2 The construction of plasmid p81

2.3 tpsA基因敲除菌株的構(gòu)建

將構(gòu)建好的p81tpsA基因敲除質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。大腸桿菌菌落PCR驗(yàn)證正確后提取質(zhì)粒，具體質(zhì)粒提取方法參見天根質(zhì)?；厥赵噭┖姓f明書。接著將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，菌落PCR驗(yàn)證正確后，準(zhǔn)備農(nóng)桿菌侵染黑曲霉實(shí)驗(yàn)。通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑曲霉轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，完成黑曲霉的遺傳轉(zhuǎn)化。挑選在10 μmol/L F2dU的CM平板上仍能正常生長的16個(gè)tpsA基因敲除轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子基因組后對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)驗(yàn)證。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3（a）所示。以質(zhì)粒p81為陽性對(duì)照，以原始基因組為陰性對(duì)照。使用引物1F/2R分別能擴(kuò)增出3.5 kb和2.8 kb的DNA條帶。以轉(zhuǎn)化子的基因組為模板，同樣使用 1F/2R 引物，其中（2、4、5、6、7、10、11、13、14、16號(hào)泳道）轉(zhuǎn)化子能擴(kuò)增出3.5 kb的單一條帶，沒有原始基因組的2.8 kb的條帶，說明這10個(gè)轉(zhuǎn)化子的tpsA基因編碼框內(nèi)的700 bp已經(jīng)被1.4 kb的潮霉素抗性片段同源重組雙交換所替代，從而破壞tpsA基因，為正確的同源重組雙交換敲除菌株。其余6個(gè)轉(zhuǎn)化子中，有4個(gè)泳道的轉(zhuǎn)化子瓊脂糖凝膠電泳圖顯示為2.8 kb包含原始菌株tpsA基因的ORF區(qū)和3.5 kb的T-DNA中隨機(jī)插入的敲除框片段的雙電泳條帶，為T-DNA隨機(jī)插入的黑曲霉轉(zhuǎn)化子；剩下兩個(gè)為原始基因的2.8 kb的單一條帶。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，tpsA基因敲除轉(zhuǎn)化子在總轉(zhuǎn)化子中比例為63%。PCR初步驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子，對(duì)其進(jìn)行左臂更左片段和右臂更右片段的擴(kuò)增。使用3F/HYG-R引物，以轉(zhuǎn)化子的基因組為模板，對(duì)其進(jìn)行左臂更左片段的擴(kuò)增，如圖3（b）所示。擴(kuò)增出了與預(yù)期結(jié)果相符的3 000 bp的片段。同樣使用HYG-F/3R引物，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行右臂更右片段的擴(kuò)增，結(jié)果如圖3（c）所示。結(jié)合圖 3（b）和圖 3（c）的瓊脂糖凝膠電泳圖的結(jié)果，說明轉(zhuǎn)化子均為原位同源重組雙交換的敲除菌株。成功構(gòu)建tpsA基因的敲除菌株Aspergillus niger101-ZM19，基因敲除流程圖如圖4所示。

圖3 黑曲霉tpsA基因敲除轉(zhuǎn)化子的分子生物學(xué)驗(yàn)證Fig.3 Verification of A.niger transformants

圖4 基因敲除流程圖Fig.4 The schematic of tpsA gene replacement in A.niger

2.4 搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證敲除突變株的有機(jī)酸產(chǎn)量

海藻糖合成酶中的tpsA與海藻糖合成有關(guān)，tpsA通過抑制己糖激酶的活性來控制葡萄糖流向糖酵解通路。葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞以后，首先經(jīng)己糖激酶催化，生成6-磷酸葡萄糖。tpsA基因被敲除時(shí)，己糖激酶的活性不再受抑制，磷酸化的己糖將大量積累，促進(jìn)葡萄糖大量流向糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)，從而有利于菌體代謝產(chǎn)酸，提高黑曲霉敲除突變株的有機(jī)酸產(chǎn)量。

使用帶渣玉米液化液進(jìn)行黑曲霉的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，控制初始還原糖含量在16%，500 mL三角瓶的玉米液化液的裝液量為50 mL，突變株和原始黑曲霉孢子接種量均為105個(gè)/mL，280 r/min，35℃發(fā)酵72小時(shí)后測(cè)發(fā)酵液中的有機(jī)酸含量。使用酸堿滴定的方法，測(cè)得突變株的有機(jī)酸含量比原始菌株提高了6.8%，產(chǎn)酸結(jié)果如圖5所示。

圖5 黑曲霉轉(zhuǎn)化子72 h搖床產(chǎn)酸驗(yàn)證Fig.5 The shaking acid of Aspergillus niger transformants

3 結(jié)論與討論

黑曲霉作為工業(yè)生產(chǎn)有機(jī)酸和酶制劑的重要菌株，其基因功能研究對(duì)于未來菌株的分子生物學(xué)改造具有指導(dǎo)性意義?；蚯贸茄芯炕蚬δ茏钪苯印⒂行У募夹g(shù)手段。黑曲霉作為真核生物，其基因敲除轉(zhuǎn)化子的篩選難度較大，正確突變株的概率較低，因此一個(gè)高效黑曲霉基因敲除體系的成功構(gòu)建會(huì)加快黑曲霉基因工程改造的速度[7]。本文利用HSVtk基因在黑曲霉中表達(dá)，導(dǎo)致其具有F2dU培養(yǎng)物中致死的特性，構(gòu)建在同源重組上游序列T-DNA插入HSVtk基因，使非同源重組轉(zhuǎn)化子在含F(xiàn)2dU培養(yǎng)基中致死，從而大大減少假陽性轉(zhuǎn)化子的數(shù)量，提高同源重組敲除突變株的篩選效率。

文獻(xiàn)報(bào)道可知，稻瘟病菌和尖孢鐮刀菌對(duì)F2dU不敏感，當(dāng)HSVtk基因的隨機(jī)插入基因組后，在含有濃度為0.5 μmol/L的F2dU培養(yǎng)基中即可導(dǎo)致稻瘟病菌和尖孢鐮刀菌的隨機(jī)插入轉(zhuǎn)化子致死[8]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黑曲霉CGMCC10142菌株隨機(jī)插入HSVtk基因，其轉(zhuǎn)化子在F2dU終濃度為10 μmol/L時(shí)，表現(xiàn)出致死特征。表明不同絲狀真菌對(duì)外源基因的表達(dá)存在較大差異，因此，不同真菌隨機(jī)插入HSVtk基因轉(zhuǎn)化子對(duì)F2dU的敏感性不同，必須進(jìn)行目標(biāo)菌株對(duì)F2dU的敏感性試驗(yàn)，以及轉(zhuǎn)化HSVtk基因后對(duì)F2dU的敏感濃度。

本試驗(yàn)黑曲霉CGMCC10142孢子對(duì)F2dU的不敏感性，在300 μmol/L的F2dU的篩選濃度下仍有50%以上的萌發(fā)率，隨機(jī)插入HSVtk基因轉(zhuǎn)化子7-1顯著提高了F2dU的敏感性，致死濃度降低到10 μmol/L，且致死率為100%。因此可以將HSVtk基因連接于敲除框的上游或下游，不易發(fā)生缺失的T-DNA區(qū)段，從而獲得黑曲霉的高效基因敲除體系。本文通過應(yīng)用該體系對(duì)黑曲霉tpsA基因的敲除，正確的基因敲除突變株在總轉(zhuǎn)化子中的比例達(dá)到63%，大大提高了陽性轉(zhuǎn)化子的篩選概率，表明該體系可高效敲除黑曲霉基因。

對(duì)于轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證，本試驗(yàn)除了驗(yàn)證敲除框的完整性，也驗(yàn)證了敲除框同源重組的位置。在同源雙交換的左臂更左70 bp和右臂更右80 bp分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行驗(yàn)證，從而將PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子的正確性提高到100%，得到一株tpsA基因敲除突變株A.niger 101-ZM19。對(duì)其進(jìn)行生長形態(tài)觀察及碳源利用效率的研究，發(fā)現(xiàn)其特性與出發(fā)菌株基本保持一致，沒有明顯變化。有研究者發(fā)現(xiàn)，在植物中tpsA基因主要控制海藻糖的合成，從而提高植物的抗逆性能[8-9]。而在絲狀真菌中實(shí)現(xiàn)tpsA基因敲除后，其分生孢子的耐熱性能降低，但其生長特性及對(duì)葡萄糖的利用速率幾乎沒有改變[10]。同時(shí)，黑曲霉tpsA基因敲除菌的檸檬酸積累時(shí)間會(huì)提前[11]。因此對(duì)于黑曲霉tpsA基因的敲除菌A.niger 101-ZM19的產(chǎn)酸性能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)酸性能得到提高，相對(duì)于出發(fā)菌株的檸檬酸產(chǎn)量提高了6.8%。