劉玲,張鴻飛,張嵐,秦酈,王德培,3,*
(1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300457;2.省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300457;3.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津300457)
黑曲霉(Aspergillus niger)作為一種重要的工業(yè)生產(chǎn)安全菌株之一,可用于有機(jī)酸、淀粉酶、酸性蛋白酶等的工業(yè)生產(chǎn)中。同時(shí)也被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥,飼料生產(chǎn),食品加工,廢料處理等領(lǐng)域[1]。因此進(jìn)一步從分子方面深入研究工業(yè)菌株黑曲霉的代謝機(jī)理,可以從微觀的角度調(diào)控基因的表達(dá),為獲得高產(chǎn)工業(yè)黑曲霉菌株奠定了理論基礎(chǔ)。目前,基因敲除是研究基因功能最為便捷準(zhǔn)確的分子生物學(xué)改造手段之一,主要應(yīng)用于對(duì)已知DNA序列的基因功能和基因調(diào)控機(jī)理研究。基因敲除以基因同源重組技術(shù)為基礎(chǔ),通過構(gòu)建帶有同源重組的DNA片段的基因敲除載體,將其轉(zhuǎn)化入目的細(xì)胞中,部分或者完全取代原始基因組中的等位基因,通過對(duì)突變體表型的分析從而反向研究基因功能的方法[2]。
工業(yè)黑曲霉基因敲除體系依賴于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑曲霉轉(zhuǎn)化體系(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT),該轉(zhuǎn)化體系的條件優(yōu)化已經(jīng)完成,大大減少了絲狀真菌的轉(zhuǎn)化操作,提高了載體上的同源DNA片段的插入效率[3]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法雖然能大幅度地提高同源重組片段的轉(zhuǎn)化效率,但是由于T-DNA自身會(huì)隨機(jī)整合到基因組中,攜帶同樣的抗性標(biāo)記造成假陽性率高,從而使篩選同源雙交換產(chǎn)生的基因敲除陽性轉(zhuǎn)化子工作的難度增大。另一方面,等位基因同源重組的效率相對(duì)T-DNA隨機(jī)插入的效率低很多,造成基因敲除陽性轉(zhuǎn)化子的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于隨機(jī)插入的轉(zhuǎn)化子的數(shù)量,因此需要篩選大量轉(zhuǎn)化子才能得到正確的基因敲除轉(zhuǎn)化子。單純皰疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,HSVtk)可在絲狀真菌中表達(dá),將培養(yǎng)基中的特定化合物5-氟脫氧尿苷(5-fluoro-2'-deoxyuridine,F(xiàn)2dU)轉(zhuǎn)變?yōu)檎婢亩拘晕镔|(zhì),導(dǎo)致真菌致死[4],因此,可在TDNA的同源重組DNA片段上游插入致死基因HSVtk基因序列,從而減少黑曲霉假陽性轉(zhuǎn)化子,提高正確基因敲除菌株的比例,從而提高篩選效率。
海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子以1,1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性二糖,其代謝的前體物質(zhì)為6-磷酸海藻糖。6-磷酸海藻糖主要是由尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖經(jīng)海藻糖6-磷酸合成酶催化合成6-磷酸海藻糖。6-磷酸海藻糖是6-磷酸葡萄糖分支代謝流的重要物質(zhì),顯著影響6-磷酸葡萄糖合成檸檬酸的轉(zhuǎn)化效率,因此敲除海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,tpsA),可以調(diào)控碳源在主代謝流的積累量,從而提高黑曲霉的檸檬酸產(chǎn)量。本文首先構(gòu)建具有致死基因HSVtk的工程菌株,獲得致死篩選濃度為10 μmol/L 5-氟脫氧尿苷,然后構(gòu)建具有單純皰疹病毒胸苷激酶和潮霉素雙標(biāo)記以敲除tpsA質(zhì)粒,通過反向篩選,減少假陽性率,高效獲得tpsA同源重組敲除菌株。
1.1.1 菌株,質(zhì)粒和引物
試驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒見表1。試驗(yàn)中用到的引物見表2。
表1 試驗(yàn)所用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in test
表2 試驗(yàn)中用到引物Table 2 The primers used in test
續(xù)表2 試驗(yàn)中用到引物Continue table 2 The primers used in test
1.1.2 培養(yǎng)基
肉湯(Luria-Bertani,LB)培養(yǎng)基用于大腸桿菌和農(nóng)桿菌液體培養(yǎng),完全培養(yǎng)基(complete medium,CM)和馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基用于黑曲霉的培養(yǎng),配制方法參照文獻(xiàn)[5]。誘導(dǎo)培養(yǎng)基(induction medium,IM),農(nóng)桿菌侵染所需培養(yǎng)基及試劑參考文獻(xiàn)[6]配制。
Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)、Prime STAR HS DNA聚合酶(2.5 U/μL)、RNaseA(5 mg/mL)、T4 DNA 連接酶(10 U/μL)、DL5000 DNA Maker、DL10000 DNA Maker、限制性內(nèi)切酶 EcoRI(15 U/μL)、SalI(15 U/μL)、KpnI(10 U/μL):TaKaRa公司;5-氟脫氧尿苷、潮霉素 B、乙酰丁香酮(acetosyringone,AS):Solarbio公司;其他試劑:天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。
潮霉素B(hygromycin):潮霉素B 100 mg,ddH2O定容至1 mL。母液濃度為100 mg/mL,工作濃度為200 μg/mL。
將實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒p80-HSVtk通過電轉(zhuǎn)化的方法,導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens(AGL1)中,再利用農(nóng)桿菌AGL1介導(dǎo)侵染黑曲霉,完成黑曲霉的遺傳轉(zhuǎn)化,具體操作方法參見曹張磊等[3]的方法進(jìn)行。
為確定黑曲霉是否適用于5-氟脫氧尿苷參與下的反向篩選體系,進(jìn)行黑曲霉對(duì)F2dU的敏感性實(shí)驗(yàn)。將質(zhì)粒p80-HSVtk電轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌AGL1中,使用攜帶質(zhì)粒p80-HSVtk的農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染原始菌株黑曲霉10142,從而獲得一株含有致死基因HSVtk的隨機(jī)插入黑曲霉轉(zhuǎn)化子7-1。取200 μL濃度均為1.3×106個(gè)/mL的突變株7-1和原始菌株的孢子懸液分別涂布于 F2dU 終濃度為 0、10、25、50、150、300 μmol/L的CM培養(yǎng)基中,35℃靜置培養(yǎng)5 d,觀察結(jié)果。
海藻糖-6-磷酸合成酶(tpsA)基因的同源重組敲除片段的構(gòu)建使用了融合PCR的方法,將同源重組左右臂,潮霉素抗性標(biāo)記以及致死基因用常規(guī)PCR分別擴(kuò)增后,融合成為tpsA基因敲除框,酶切連接完成p81質(zhì)粒的構(gòu)建。首先以p44質(zhì)粒為模板,以HYG-F/HYG-R為引物(本文所用引物堿基序列見表2),常規(guī)PCR反應(yīng)擴(kuò)增1.4 kb的潮霉素抗性片段。同時(shí)以pBHt2-tk質(zhì)粒為模板,以HSVtk-F/HSVtk-R為上下游引物,PCR擴(kuò)增1.8 kb的HSVtk基因片段。以黑曲霉基因組為模板,以1F/1R和2F/2R為引物,PCR擴(kuò)增長度均為1 kb左右的tpsA基因同源重組左右臂片段。其中引物1F的5’端含有與HSVtk-R互為反向互補(bǔ)的接頭序列,引物2F的5’端含有與HYG-R互為反向互補(bǔ)的接頭序列。從而獲得末端含有相應(yīng)互為反向互補(bǔ)序列的4個(gè)PCR產(chǎn)物。使用融合PCR的方法擴(kuò)增2.8 kb的HSVtk和同源左臂的融合片段,使用限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRI雙酶切連接的方法將此片段連接到質(zhì)粒p40中。同樣的方法,使用限制性內(nèi)切酶KpnI和SalI將HYG和同源右臂的融合片段雙酶切連接到過程質(zhì)粒p40-HSVtk-L中。從而完成敲除質(zhì)粒p81的構(gòu)建。
將農(nóng)桿菌AGL1介導(dǎo)侵染黑曲霉后的孢子,涂布于濃度為200 mg/mL的潮霉素B的抗性平板上,待長出單菌落點(diǎn)接到10 μmol/L濃度的F2dU平板中,35℃培養(yǎng)5天后,挑出能正常生長菌株即可能的同源重組陽性轉(zhuǎn)化子,提取基因組并利用PCR的方法進(jìn)行分子生物學(xué)驗(yàn)證。
為了確定F2dU的篩選濃度,必須獲得一株含有HSVtk基因的黑曲霉隨機(jī)插入轉(zhuǎn)化子。將質(zhì)粒p80-HSVtk電轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌AGL1中,使用攜帶質(zhì)粒p80-HSVtk的農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染原始菌株黑曲霉10142,通過潮霉素抗性篩選獲得一株含有致死基因HSVtk的隨機(jī)插入黑曲霉轉(zhuǎn)化子7-1。在F2dU終濃度分別為0、10、25、50、150、300 μmol/L 的 CM 平板上,觀察突變株7-1和原始菌株對(duì)F2dU的敏感性。觀察結(jié)果如圖1所示。
含有HSVtk基因的黑曲霉轉(zhuǎn)化子在濃度為10 μmol/L的F2dU的CM平板上,孢子完全無法萌發(fā)。因此選用10 μmol/L的F2dU當(dāng)作轉(zhuǎn)化子的篩選濃度即可抑制含HSVtk的T-DNA隨機(jī)插入轉(zhuǎn)化子的生長,從而大大減少篩選操作,提高陽性轉(zhuǎn)化子的比例。同時(shí)原始菌株在含有10 μmol/L F2dU的CM平板上生長并不受到影響。證明該反向篩選方法可減少隨機(jī)插入轉(zhuǎn)化子的概率,提高黑曲霉原位同源重組轉(zhuǎn)化子的篩選效率。
圖1 黑曲霉7-1和原始菌株在含有不同濃度F2dU的CM培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d的生長情況Fig.1 The growth of 7-1 and A.niger 10142 on CM plates with the different F2dU concentrations after 3 d
通過常規(guī)PCR反應(yīng),得到長度分別為1.8、1.0、1.4、1.0 kb的HSVtk基因片段,同源重組左臂片段,HYG基因片段和同源重組右臂片段。利用融合PCR,將HSVtk基因和同源左臂這2個(gè)DNA片段末端反向互補(bǔ)序列相互結(jié)合,構(gòu)建2.8 kb的HSVtk和同源左臂的融合片段,同樣的方法,得到2.4 kb的HYG和同源右臂的融合片段。先通過KpnI和EcoRI處理質(zhì)粒p40和2.8 kb的融合片段,再過夜連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽性轉(zhuǎn)化子后得到過程質(zhì)粒p40-HSVtk-L。再使用同樣的方法,使用KpnI和SalI將2.4 kb的融合片段連接到過程質(zhì)粒p40-HSVtk-L中,完成敲除質(zhì)粒p81的構(gòu)建,見圖2。
圖2 tpsA基因敲除質(zhì)粒p81構(gòu)建Fig.2 The construction of plasmid p81
將構(gòu)建好的p81tpsA基因敲除質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。大腸桿菌菌落PCR驗(yàn)證正確后提取質(zhì)粒,具體質(zhì)粒提取方法參見天根質(zhì)?;厥赵噭┖姓f明書。接著將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,菌落PCR驗(yàn)證正確后,準(zhǔn)備農(nóng)桿菌侵染黑曲霉實(shí)驗(yàn)。通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑曲霉轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),完成黑曲霉的遺傳轉(zhuǎn)化。挑選在10 μmol/L F2dU的CM平板上仍能正常生長的16個(gè)tpsA基因敲除轉(zhuǎn)化子,提取轉(zhuǎn)化子基因組后對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)驗(yàn)證。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3(a)所示。以質(zhì)粒p81為陽性對(duì)照,以原始基因組為陰性對(duì)照。使用引物1F/2R分別能擴(kuò)增出3.5 kb和2.8 kb的DNA條帶。以轉(zhuǎn)化子的基因組為模板,同樣使用 1F/2R 引物,其中(2、4、5、6、7、10、11、13、14、16號(hào)泳道)轉(zhuǎn)化子能擴(kuò)增出3.5 kb的單一條帶,沒有原始基因組的2.8 kb的條帶,說明這10個(gè)轉(zhuǎn)化子的tpsA基因編碼框內(nèi)的700 bp已經(jīng)被1.4 kb的潮霉素抗性片段同源重組雙交換所替代,從而破壞tpsA基因,為正確的同源重組雙交換敲除菌株。其余6個(gè)轉(zhuǎn)化子中,有4個(gè)泳道的轉(zhuǎn)化子瓊脂糖凝膠電泳圖顯示為2.8 kb包含原始菌株tpsA基因的ORF區(qū)和3.5 kb的T-DNA中隨機(jī)插入的敲除框片段的雙電泳條帶,為T-DNA隨機(jī)插入的黑曲霉轉(zhuǎn)化子;剩下兩個(gè)為原始基因的2.8 kb的單一條帶。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),tpsA基因敲除轉(zhuǎn)化子在總轉(zhuǎn)化子中比例為63%。PCR初步驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子,對(duì)其進(jìn)行左臂更左片段和右臂更右片段的擴(kuò)增。使用3F/HYG-R引物,以轉(zhuǎn)化子的基因組為模板,對(duì)其進(jìn)行左臂更左片段的擴(kuò)增,如圖3(b)所示。擴(kuò)增出了與預(yù)期結(jié)果相符的3 000 bp的片段。同樣使用HYG-F/3R引物,對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行右臂更右片段的擴(kuò)增,結(jié)果如圖3(c)所示。結(jié)合圖 3(b)和圖 3(c)的瓊脂糖凝膠電泳圖的結(jié)果,說明轉(zhuǎn)化子均為原位同源重組雙交換的敲除菌株。成功構(gòu)建tpsA基因的敲除菌株Aspergillus niger101-ZM19,基因敲除流程圖如圖4所示。
圖3 黑曲霉tpsA基因敲除轉(zhuǎn)化子的分子生物學(xué)驗(yàn)證Fig.3 Verification of A.niger transformants
圖4 基因敲除流程圖Fig.4 The schematic of tpsA gene replacement in A.niger
海藻糖合成酶中的tpsA與海藻糖合成有關(guān),tpsA通過抑制己糖激酶的活性來控制葡萄糖流向糖酵解通路。葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞以后,首先經(jīng)己糖激酶催化,生成6-磷酸葡萄糖。tpsA基因被敲除時(shí),己糖激酶的活性不再受抑制,磷酸化的己糖將大量積累,促進(jìn)葡萄糖大量流向糖酵解途徑和三羧酸循環(huán),從而有利于菌體代謝產(chǎn)酸,提高黑曲霉敲除突變株的有機(jī)酸產(chǎn)量。
使用帶渣玉米液化液進(jìn)行黑曲霉的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn),控制初始還原糖含量在16%,500 mL三角瓶的玉米液化液的裝液量為50 mL,突變株和原始黑曲霉孢子接種量均為105個(gè)/mL,280 r/min,35℃發(fā)酵72小時(shí)后測(cè)發(fā)酵液中的有機(jī)酸含量。使用酸堿滴定的方法,測(cè)得突變株的有機(jī)酸含量比原始菌株提高了6.8%,產(chǎn)酸結(jié)果如圖5所示。
圖5 黑曲霉轉(zhuǎn)化子72 h搖床產(chǎn)酸驗(yàn)證Fig.5 The shaking acid of Aspergillus niger transformants
黑曲霉作為工業(yè)生產(chǎn)有機(jī)酸和酶制劑的重要菌株,其基因功能研究對(duì)于未來菌株的分子生物學(xué)改造具有指導(dǎo)性意義?;蚯贸茄芯炕蚬δ茏钪苯印⒂行У募夹g(shù)手段。黑曲霉作為真核生物,其基因敲除轉(zhuǎn)化子的篩選難度較大,正確突變株的概率較低,因此一個(gè)高效黑曲霉基因敲除體系的成功構(gòu)建會(huì)加快黑曲霉基因工程改造的速度[7]。本文利用HSVtk基因在黑曲霉中表達(dá),導(dǎo)致其具有F2dU培養(yǎng)物中致死的特性,構(gòu)建在同源重組上游序列T-DNA插入HSVtk基因,使非同源重組轉(zhuǎn)化子在含F(xiàn)2dU培養(yǎng)基中致死,從而大大減少假陽性轉(zhuǎn)化子的數(shù)量,提高同源重組敲除突變株的篩選效率。
文獻(xiàn)報(bào)道可知,稻瘟病菌和尖孢鐮刀菌對(duì)F2dU不敏感,當(dāng)HSVtk基因的隨機(jī)插入基因組后,在含有濃度為0.5 μmol/L的F2dU培養(yǎng)基中即可導(dǎo)致稻瘟病菌和尖孢鐮刀菌的隨機(jī)插入轉(zhuǎn)化子致死[8]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黑曲霉CGMCC10142菌株隨機(jī)插入HSVtk基因,其轉(zhuǎn)化子在F2dU終濃度為10 μmol/L時(shí),表現(xiàn)出致死特征。表明不同絲狀真菌對(duì)外源基因的表達(dá)存在較大差異,因此,不同真菌隨機(jī)插入HSVtk基因轉(zhuǎn)化子對(duì)F2dU的敏感性不同,必須進(jìn)行目標(biāo)菌株對(duì)F2dU的敏感性試驗(yàn),以及轉(zhuǎn)化HSVtk基因后對(duì)F2dU的敏感濃度。
本試驗(yàn)黑曲霉CGMCC10142孢子對(duì)F2dU的不敏感性,在300 μmol/L的F2dU的篩選濃度下仍有50%以上的萌發(fā)率,隨機(jī)插入HSVtk基因轉(zhuǎn)化子7-1顯著提高了F2dU的敏感性,致死濃度降低到10 μmol/L,且致死率為100%。因此可以將HSVtk基因連接于敲除框的上游或下游,不易發(fā)生缺失的T-DNA區(qū)段,從而獲得黑曲霉的高效基因敲除體系。本文通過應(yīng)用該體系對(duì)黑曲霉tpsA基因的敲除,正確的基因敲除突變株在總轉(zhuǎn)化子中的比例達(dá)到63%,大大提高了陽性轉(zhuǎn)化子的篩選概率,表明該體系可高效敲除黑曲霉基因。
對(duì)于轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證,本試驗(yàn)除了驗(yàn)證敲除框的完整性,也驗(yàn)證了敲除框同源重組的位置。在同源雙交換的左臂更左70 bp和右臂更右80 bp分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行驗(yàn)證,從而將PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子的正確性提高到100%,得到一株tpsA基因敲除突變株A.niger 101-ZM19。對(duì)其進(jìn)行生長形態(tài)觀察及碳源利用效率的研究,發(fā)現(xiàn)其特性與出發(fā)菌株基本保持一致,沒有明顯變化。有研究者發(fā)現(xiàn),在植物中tpsA基因主要控制海藻糖的合成,從而提高植物的抗逆性能[8-9]。而在絲狀真菌中實(shí)現(xiàn)tpsA基因敲除后,其分生孢子的耐熱性能降低,但其生長特性及對(duì)葡萄糖的利用速率幾乎沒有改變[10]。同時(shí),黑曲霉tpsA基因敲除菌的檸檬酸積累時(shí)間會(huì)提前[11]。因此對(duì)于黑曲霉tpsA基因的敲除菌A.niger 101-ZM19的產(chǎn)酸性能進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)酸性能得到提高,相對(duì)于出發(fā)菌株的檸檬酸產(chǎn)量提高了6.8%。