（廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西南寧530021）

真菌毒素（mycotoxin）是一類產(chǎn)自絲狀真菌的有毒次生代謝產(chǎn)物[1]，常見(jiàn)的真菌毒素有黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）、赭曲霉毒素（ochratoxin，OT）、伏馬菌素（fumonisin，F(xiàn)B）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）等，在適宜的環(huán)境下，能侵襲、污染各種農(nóng)作物，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量，降低農(nóng)產(chǎn)品以及飼料的營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。研究表明，真菌毒素具有DNA毒性和細(xì)胞毒性，會(huì)致癌、致畸和致突變，且抑制家畜的免疫及生長(zhǎng)。若人畜以較高的等級(jí)暴露在這些毒素污染物中，最終誘發(fā)種種生理危害，即所謂的霉菌毒素綜合征（mycotoxicoses）[3-6]。因此，真菌毒素的監(jiān)控問(wèn)題迫在眉睫。

真菌毒素的主要分析方法有薄層色譜法（thinlayer chromatography，TLC）[7]、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）[8-9]、液相色譜法（liquid chromatography，LC）[10-11]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS/MS）[12-13]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（gas chromatograph mass spectrometer，GC-MS/MS）[14]。液相色譜是最常用的檢測(cè)方法，但其靈敏度低，并且干擾大，無(wú)法滿足多毒素同時(shí)檢測(cè)；薄層色譜法簡(jiǎn)單、便利，但精密度與重現(xiàn)性欠缺；免疫化學(xué)檢測(cè)法特異性強(qiáng)，但假陽(yáng)性率過(guò)高；氣質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜法雖然滿足了精密度、靈敏度的要求，但前處理需要衍生，耗時(shí)太長(zhǎng)，無(wú)法滿足大批量檢測(cè)的需求；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法兼具了前處理無(wú)需衍生，操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性強(qiáng)，靈敏度高，精密度好，能滿足多樣品多通量的檢測(cè)要求的特點(diǎn)，已經(jīng)越來(lái)越受到真菌毒素檢測(cè)領(lǐng)域的青睞。高效液相色譜串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-linear ion trap mass spectrometer，UPLC-Q-trap MS）兼具液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的優(yōu)點(diǎn)，以信息依賴性掃描（information de pendent acquisition，IDA）的邏輯選項(xiàng)（criteria）整合探測(cè)掃描（survey scan）和觸發(fā)掃描（dependent scan），實(shí)現(xiàn)在一次采樣中同時(shí)獲得兩種或兩種以上不同采樣模式的數(shù)據(jù)，定量的同時(shí)可以兼顧定性，降低假陽(yáng)性率。

QuEChERS于2003年提出，是一種均質(zhì)后的樣品經(jīng)乙腈（或酸化乙腈）提取，采用萃取鹽包鹽析分層后，利用分散固相萃取機(jī)理，采用N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）吸附劑或其它吸附劑與基質(zhì)中絕大部分干擾物（有機(jī)酸、脂肪酸、碳水化合物等）結(jié)合，通過(guò)離心方式去除，從而達(dá)到凈化樣品溶液的一種樣品前處理方法[15]，具有快速（Quick）、簡(jiǎn)便（Easy）、節(jié)約（Cheap）、高 效（Effective）、耐 用（Rugged）、安 全（Safe）的特點(diǎn)[16-18]。本研究采用基于QuEChERS改造的提取方法（DisQuE QuEChERS），用含10%甲酸的乙腈溶液進(jìn)行樣品的提取，提取液經(jīng)QuEChERS提取鹽包進(jìn)行鹽析分層，上清液經(jīng)過(guò)SPE小柱、分散固相萃取凈化管凈化，高效液相色譜-線性離子阱法（UPLC-Q-trap MS）進(jìn)行真菌毒素的定性、定量檢測(cè)，該方法操作簡(jiǎn)便，安全，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，有助于假陽(yáng)性樣品的排除，為食藥安全提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DGU-20A5R高效液相色譜儀：日本島津公司；Qtrap 4500三重四級(jí)桿質(zhì)譜：美國(guó)AB SCIEX公司；離心機(jī)（型號(hào)ROTANTA460/460R）：德國(guó)Hettich科學(xué)儀器公司；震蕩儀（型號(hào)KS260）：德國(guó)IKA儀器設(shè)備有限公司；氮吹儀（型號(hào) Multivap）：美國(guó)Organomation公司；Milli-Q超純水機(jī)（型號(hào)A10）：美國(guó)Milli-pore公司；ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（2.1×100 mm，1.8 μm）：美國(guó)Waters公司。

乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）：德國(guó)默克公司；QuEChERS 提取鹽包 （0.5 g Na Sesquihydrate，1.5 g NaCitrate/1 g NaCl/4 g MgSO4）、Oasis PRiME HLB 小柱（3 cc，150 mg）、凈化管（2 mL，150 mg MgSO4/50 mg PSA/30 mg C18/30 mg Al N）：美國(guó) Waters公司。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Biopure公司，100 μg/mL，deoxynivalenol，DON）、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 [Romer公司，（101.0±1.4）μg/mL，3-acetyldeoxynivalenol，3-ADON]、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇[Romer公司，（100.5±0.6）μg/mL，15-acetyldeoxynivalenol，15-ADON]、伏馬毒素B（1Romer公司，50.0 μg/mL，fumonisinB1，F(xiàn)B）1、伏馬毒素B（2Romer公司，50.2 μg/mL，fumonisinB2，F(xiàn)B）2、伏馬毒素B（3Romer公司，50.1 μg/mL，fumonisin B3，F(xiàn)B3）、黃曲霉 毒 素 B1（Pribolab 公司，10 μg/mL，aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素B（2Pribolab公司，10 μg/mL，aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素 G1（Pribolab 公司，10 μg/mL，aflatoxin G1，AFG1）、黃曲霉毒素 G2（Pribolab 公司，10 μg/mL，aflatoxin G2，AFG2）、玉米赤霉烯酮（Biopure公司，100 μg/mL，zearalenone，ZEA）、赭曲霉毒素 A（SUPELCO 公司，50 μL/mL，ochratoxin，OTA）。

大米、小麥、玉米：均來(lái)自南寧市某超市和廣西區(qū)抽樣品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的前處理

QuEChERS提取：稱取2 g樣品，裝入50 mL離心管中。加入10 mL水和10 mL含10%甲酸的乙腈溶液，將樣品置于自動(dòng)振蕩器中振搖1 h。然后加入QuEChERS提取鹽包，劇烈振搖1 min，于4 500 r/min下離心5 min，上清液備用。

凈化：吸取0.4 mL上清液過(guò)Oasis PRiME HLB小柱，棄去濾液，再吸取1 mL上清液于小柱并收集濾液。將收集到的濾液轉(zhuǎn)移到凈化管中，于4 500 r/min下離心1 min，取500 μL上清液，氮吹至近干，用15%乙腈溶液 250 μL 溶解，超聲 30 s，渦旋混勻，過(guò) 0.22 μm 濾膜，即得。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制

精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，分別用甲醇配制成濃度約為200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，供優(yōu)化各化合物質(zhì)譜參數(shù)使用。

基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制：取空白大米、小麥、玉米樣品，按“1.2.1樣品的前處理”方法制備，上清液轉(zhuǎn)移至氮吹管中，分別加入各真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，氮?dú)獯蹈珊螅尤?5%乙腈溶液復(fù)溶，超聲30 s，渦旋混勻，過(guò)0.22 μm濾膜，即得，混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液濃度見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中各真菌毒素的濃度Table 1 The concentration for 12 kinds of mycotoxins

1.2.3 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相：A為含0.1%甲酸水溶液，B為含0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～1 min，5%B；1 min～5 min，5%～70%B；5 min～5.1 min，70%～95%B；5.1 min～12 min，95%B；12 min～12.1 min，95%～5%B；12.1 min～15 min，5%B；流速：300 μL/min。

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子（electron spray ionization，ESI）源；正離子掃描模式；氣簾氣（curtain gas，CUR）：2.4×105Pa；碰撞氣（collision gas，CAD）：High；離子化電壓（ionspray voltage，IS）：4 500 V；輔助氣溫度（Temperature，TEM）：500 ℃；霧化氣（ion source gas1，GS1）：3.8×105Pa；輔助氣（ion source gas2，GS2）：3.8×105Pa；入口電壓（declustering potential，EP）：10 V；碰撞室出口電壓（cell exit potential，CXP）：13 V。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）參數(shù)設(shè)置：各化合物母離子、子離子及能量參數(shù)等見(jiàn)表2。

表2 12種真菌毒素的保留時(shí)間、母離子、子離子和能量參數(shù)Table 2 The retention time，precursor ions，product ions and energy parameters for 12 kinds of mycotoxins

續(xù)表2 12種真菌毒素的保留時(shí)間、母離子、子離子和能量參數(shù)Continue table 2 The retention time，precursor ions，product ions and energy parameters for 12 kinds of mycotoxins

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用獨(dú)立針泵直接進(jìn)樣，分別將12種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 ng/mL）在質(zhì)譜Manual Tuning模式下進(jìn)樣分析。由于12種真菌毒素均屬于極性化合物，故選擇適用于中等極性、極性化合物的電噴霧離子（ESI）源。比較化合物母離子在正、負(fù)離子模式的響應(yīng)，綜合考慮，選擇了正離子電離模式。隨后優(yōu)化了母離子的DP電壓，在Product Ion（MS2）模式下選擇了相對(duì)豐度較高的兩個(gè)離子分別作為定量離子和定性離子，并在MRM模式下優(yōu)化了對(duì)應(yīng)離子的CE電壓，CXP電壓等參數(shù)，最后連接液相，進(jìn)一步優(yōu)化CUR、IS等離子源參數(shù)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液與樣品的總離子流圖Fig.1 The total ion chromatography of standard solution and rice sample solution

2.2 流動(dòng)相條件及溶劑的優(yōu)化

綜合考慮各毒素的pKa值，化合物的電離及加氫離子的形成等因素，比較了在流動(dòng)相中加入0.1%、0.2%、0.5%甲酸相應(yīng)的化合物強(qiáng)度，最終選擇0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液作為流動(dòng)相。標(biāo)準(zhǔn)品溶液和大米樣品的的總離子流圖見(jiàn)圖1；標(biāo)準(zhǔn)品溶液的子離子圖見(jiàn)圖2。

圖2 12種生物毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的總離子圖Fig.2 The total ion chromatography for standard solution of 12 kinds of mycotoxins

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)的考察

2.3 樣品前處理方法的考察

本試驗(yàn)用含10%甲酸的乙腈溶液提取樣品，鹽包鹽析分層，并利用凈化管中MgSO4去除提取液中微量的水，PSA除去樣品中酸性物質(zhì)或者糖，C18去除脂肪、油等非極性化合物，中性氧化鋁從弱、中極性溶劑中吸附極性雜質(zhì)，達(dá)到凈化樣品的目的。由于商品化的凈化管填料更具均勻性，利于試驗(yàn)的穩(wěn)定性，保證結(jié)果的重現(xiàn)性，故選擇了商品化的2 mL凈化管。

基質(zhì)效應(yīng)是樣品中被分析物以外的組分，會(huì)干擾分析物的分析過(guò)程及影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[19]。在LC-MS檢測(cè)中，基質(zhì)效應(yīng)主要表現(xiàn)在待測(cè)成分的共流物競(jìng)爭(zhēng)性抑制或增強(qiáng)待測(cè)組分的電離，從而干擾其測(cè)定，進(jìn)而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性[20-25]。比較了以15%乙腈溶液、空白樣品提取液配制的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液對(duì)樣品回收率的影響，結(jié)果表明大米、小麥、玉米都存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，有增強(qiáng)也有減弱。在小麥粉中，15%乙腈溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算FB1添加水平為200μg/kg時(shí)其回收率為102%，而用空白樣品提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得回收率僅為73%；在玉米粉中，15%乙腈溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算AFTB1添加水平為2 μg/kg時(shí)回收率為42%，而用空白樣品提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算則回收率為93%。綜合考慮，采用空白樣品提取液配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

此外，通過(guò)考察樣品經(jīng)鹽析包、凈化管處理后能消除大部分雜質(zhì)，但不能去除磷脂干擾。由于稻米、小麥等谷物中存在的磷脂會(huì)干擾LC-MS分析、污染色譜柱和UPLC系統(tǒng)、質(zhì)譜儀，對(duì)儀器造成傷害。通過(guò)母離子掃描方式（precursor ion），監(jiān)測(cè)大部分磷脂中共存的質(zhì)荷比為184的碎片離子，研究發(fā)現(xiàn)采用Oasis PRiME HLB小柱凈化樣品提取物，可達(dá)到去除大量磷脂的目的，減輕磷脂對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的污染，降低樣品檢測(cè)的干擾及提高色譜柱的壽命。樣品提取物經(jīng)Oasis PRiME HLB凈化前后總離子流圖見(jiàn)圖3。

圖3 樣品提取物經(jīng)HLB小柱凈化前后的總離子流圖Fig.3 The total ion chromatography of sample extracts solutions before and after purified by HLB cartridges

2.3.2 溶劑效應(yīng)的考察

溶劑效應(yīng)是樣品溶劑強(qiáng)度大于流動(dòng)相強(qiáng)度時(shí)造成色譜峰變形的現(xiàn)象，對(duì)色譜中出峰時(shí)間較早的化合物影響較大[26-29]。溶劑效應(yīng)雖可通過(guò)降低進(jìn)樣體積達(dá)到理想的效果，但出于檢出限的考量，考察了不同比例乙腈作為溶劑時(shí)的溶劑效應(yīng)。吸取500 μL凈化后的上清液，在溫和的氮?dú)饬髦袚]干，復(fù)溶于250 μL不同比例的乙腈溶液中，最終均衡化合物的溶解性，選擇了15%乙腈溶液作為樣品溶劑，這樣既可降低溶劑強(qiáng)度，起到了消除溶劑效應(yīng)的目的，又減少了樣品的稀釋倍數(shù)，提高樣品的儀器響應(yīng)。不同比例乙腈水溶液濃度對(duì)出峰時(shí)間最早的DON的影響見(jiàn)圖4。

圖4 溶劑效應(yīng)圖Fig.4 The chromatography of solvent effect

2.4 線性離子阱（Qtrap）

線性離子阱為離子阱的一種，在傳統(tǒng)的三重四級(jí)桿質(zhì)譜（triple quadrupole mass spectrometer，QQQ）的基礎(chǔ)上，Q3除了離子篩選等功能外，兼具有線性離子阱的離子捕獲、阱集等功能。通過(guò)信息依賴性掃描的邏輯選項(xiàng)整合諸如多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）、中性丟失（neutral loss，NL）、母離子掃描（precursor，Prec）等的探測(cè)掃描和增強(qiáng)質(zhì)譜掃描（enhanced scan，ES）、增強(qiáng)子離子掃描（enhanced product ion，EPI）、增強(qiáng)分辨率掃描（enhanced resolution，ER）、三級(jí)質(zhì)譜掃描（MS3）等觸發(fā)掃描，達(dá)到在一次采樣中同時(shí)獲得兩種或兩種以上不同采集模式的數(shù)據(jù)的目的[30-34]。研究采用典型的MRM觸發(fā)EPI模式，當(dāng)在MRM模式采樣過(guò)程中，一旦某個(gè)通道“出現(xiàn)”色譜峰，并且出峰狀況達(dá)到預(yù)設(shè)的要求，質(zhì)譜將在1 ms內(nèi)將Q3切換成線性離子阱，并對(duì)該通道的母離子執(zhí)行子離子增強(qiáng)掃描（EPI），獲得它的二級(jí)譜圖。由于此二級(jí)譜圖為母離子經(jīng)過(guò)線性離子阱的富集后所得，靈敏度得到了很大的提高。即此模式既可實(shí)現(xiàn)MRM常規(guī)的定量、一般的定性功能，又可對(duì)經(jīng)EPI獲得的更加豐富的特征性二級(jí)碎片離子進(jìn)行進(jìn)一步的定性確認(rèn)，大大降低了樣品的假陽(yáng)性率。利用標(biāo)準(zhǔn)品溶液通過(guò)質(zhì)譜軟件建立了12種真菌毒素的二級(jí)碎片譜庫(kù)，通過(guò)匹配度（purity）便捷的篩查和確證疑似陽(yáng)性樣品，具體譜圖及特征性離子見(jiàn)圖5和圖6，由圖6可見(jiàn)大米回收樣品中的FB2的二級(jí)圖譜與標(biāo)準(zhǔn)溶液中所建的二級(jí)圖譜一致。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 儀器精密度

取系列濃度曲線最低點(diǎn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，并計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果表明，RSD 均在 1%以內(nèi)，符合儀器對(duì)精密度的要求。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及加標(biāo)回收率

對(duì)基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液進(jìn)行測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取大米、小麥、玉米樣品各18份，平均分3組，每組加入不同濃度的混合對(duì)照，按1.2.1樣品的前處理操作，然后上機(jī)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖6 大米樣品中FB2與所建譜庫(kù)中FB2二級(jí)譜圖Fig.6 The fragments of FB2in rice and standard library

表3 12種真菌毒素在3種基質(zhì)中的加標(biāo)回收率、精密度（n=6）及儀器檢出限Table 3 Results of recoveries、precision（RSD）and limits of detection（LOD）of 12 mycotoxins in different samples（n=6）

由表3可知，12種真菌毒素在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)均大于0.995，各樣品加標(biāo)回收率在59%～112%之間，每組的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8%（n=6），個(gè)別成分的回收率偏低，可能是由于基質(zhì)效應(yīng)的影響，或者提取過(guò)程中諸如固體分散相的吸附，提取溶液的酸堿度影響，有待進(jìn)一步考察。

2.5.3 穩(wěn)定性

回收樣品溶液分別放置 0、12、24、48、72、96 小時(shí)后進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各真菌毒素峰面積的RSD均在2%內(nèi)，表明各真菌毒素可在回收樣品溶液中穩(wěn)定保存。

2.5.4 儀器檢出限

以基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的最低點(diǎn)進(jìn)樣，信噪比均大于3，計(jì)算信噪比為3時(shí)化合物的濃度即為儀器檢出限。玉米基質(zhì)的儀器檢出限見(jiàn)表3。

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

本研究方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求方法對(duì)2017年的部分監(jiān)督抽樣樣品進(jìn)行平行測(cè)定，兩者結(jié)果基本一致。其中2批疑似檢出AFB1的樣品，通過(guò)譜庫(kù)的匹配與特征離子的校對(duì)，排除了陽(yáng)性結(jié)果的可能。

3 結(jié)論

本研究主要針對(duì)谷物中較具代表性的大米、玉米、小麥基質(zhì)，建立12種真菌毒素的UPLC-Q-trap MS高通量篩查和定量方法，該方法操作簡(jiǎn)便，安全，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，利用線性離子阱的功能，增強(qiáng)化合物二級(jí)碎片離子的靈敏度，在準(zhǔn)確定量的同時(shí)，定性功能進(jìn)一步加強(qiáng)，有助于假陽(yáng)性樣品的排除，利于食藥領(lǐng)域的監(jiān)督管理，為食藥安全提供有力的技術(shù)支持。