孟翔宇，趙彥巧，李建穎

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134）

玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa）是藥食兩用植物，又名洛神花，是錦葵科木槿屬一年生植物[1]。其中富含豐富的花色素、酚類、氨基酸、有機(jī)酸和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分[2]。然而，作為天然色素的一大類-花色苷，受到了各界人士的普遍重視。近年來研究發(fā)現(xiàn)，花色苷不僅在不同溶劑條件下可呈現(xiàn)紅、藍(lán)、紫等不同顏色，能滿足不同的著色需求[3]，而且安全無毒，并具有較強(qiáng)的抗氧化[4-7]、抗炎癥[8]、抗癌[9-11]，能力和顯著的心血管保護(hù)能力[12-13]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，玫瑰茄花色苷的提取方法有超聲輔助提取法[14]、溶劑提取法[15]和微波提取法[16]。但是已有方法普遍存在溶劑使用量大、作用時間長、原料損耗嚴(yán)重等問題，導(dǎo)致花色苷提取率低，穩(wěn)定性不高，給后續(xù)的開發(fā)利用帶來難度。

超聲波能產(chǎn)生一系列空化效應(yīng)以及強(qiáng)烈的振動擊碎和擴(kuò)散等復(fù)雜的多級效應(yīng)，提高分子的振動頻率，增強(qiáng)溶劑的穿透力，來促進(jìn)提取[17]。微波的熱效應(yīng)和形成的局部壓力可破壞生物原料的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加速內(nèi)容物的溶出[18-19]。而新型超聲-微波協(xié)同提取充分利用超聲波的空化作用以及微波的熱效應(yīng)，使超聲波產(chǎn)生的振蕩作用能有效彌補(bǔ)微波傳熱、傳質(zhì)不均等缺陷，微波極佳的熱效應(yīng)能有效地彌補(bǔ)超聲產(chǎn)熱不足的問題[20]。本研究利用超聲-微波協(xié)同萃取儀進(jìn)行提取，并結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化玫瑰茄花色苷的提取工藝，來實(shí)現(xiàn)低溫常壓條件下對樣品進(jìn)行快速、高效的提取。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰茄：云南武定；氯化鉀（AR）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；濃鹽酸（AR）：天津化學(xué)試劑五廠；無水醋酸鈉（AR）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（AR）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RHP-400型高速多功能粉碎機(jī)：浙江榮浩工貿(mào)有限公司；UV-2600紫外-可見分光光度計(jì)：日本島津；真空冷凍干燥系統(tǒng)：科儀創(chuàng)智（北京）科技發(fā)展有限公司；STARTER 3100 pH計(jì)、AX224ZH分析天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；XO-SM100超聲-微波協(xié)同萃取儀：南京先歐儀器制造有限公司；RV10數(shù)顯型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA；-80℃低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司；DLK-2007快速低溫冷卻循環(huán)機(jī)：寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰茄原料預(yù)處理

挑選無腐爛霉變的玫瑰茄干花萼，40℃烘干，經(jīng)粉碎機(jī)處理，過40目～60目標(biāo)準(zhǔn)篩，得原材料，密封冷藏備用。

1.3.2 玫瑰茄花色苷提取工藝

稱取玫瑰茄原材料2.5 g，按液料比36∶1（mL/g）加入乙醇溶液（pH=3），安裝好冷凝回流裝置，設(shè)置超聲功率350 W，微波功率279 W，提取溫度50℃，應(yīng)用超聲微波萃取儀，提取18 min，抽濾，測定吸光度。

1.3.3 花色苷吸收波長的測定

在190 nm～700 nm下對玫瑰茄花色苷進(jìn)行全波長掃描，確定其最大吸收波長。

1.3.4 花色苷含量的測定

參照pH示差法[21]測定總花色苷含量。取玫瑰茄花色苷提取液，分別加入pH1.0[0.2 mol/L HCl∶0.2 mol/L KCl=25 ∶67（體積比）]和 pH4.5[1.0 mol/L CH3COONa∶1.0 mol/L HCl∶H2O=100∶60∶90（體積比）]的緩沖溶液，將花色苷提取液稀釋10倍，室溫下平衡80 min，以蒸餾水作參比，在520 nm和700 nm下測定吸光度，花色苷提取量按以下公式計(jì)算：

式中：M為矢車菊素葡萄糖苷（Cyanidin-3-glucoside） 的分子量，449.2 g/mol；W 為樣品質(zhì)量，g；V為提取液體積，mL；F為稀釋倍數(shù)；ε為摩爾消光系數(shù)26 900 L（/mol·cm）；A為總吸光度。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化花色苷提取工藝

響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外-可見掃描光譜

玫瑰茄花色苷紫外-可見吸收光譜如圖1所示。

圖1 花色苷紫外可見光譜Fig.1 UV-visible spectrum of anthocyanin

由圖1可見，玫瑰茄花色苷在283 nm和520 nm有最大吸收，符合花色苷的特征吸收。而干擾花色苷分析的其他類黃酮化合物，在紫外區(qū)240 nm～285 nm有特征吸收峰[22]，這與吳慶智等[23]研究報(bào)道一致。因此，將520 nm作為玫瑰茄花色苷的最大特征吸收波長。且該物質(zhì)在327 nm也有吸收，推斷該花色苷中可能有酰基存在[24]。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲功率對花色苷提取量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù) 60%，液料比 35 ∶1（mL/g），微波功率280 W，提取溫度50℃，提取18 min，考察不同超聲功率對花色苷提取量的影響，如圖2所示。

圖2 超聲功率對花色苷提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the yield of anthocyanin

由圖2可見，隨超聲功率增加，花色苷提取量呈現(xiàn)先增加后減小趨勢，最大提取量為772.9 mg/100 g。但超聲功率超過350 W時，超聲功率對花色苷提取量的影響不顯著，所以后續(xù)不再進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)。因此，本研究確定最佳的超聲功率為350 W。

2.2.2 提取溫度對花色苷提取量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù) 60%，液料比 35 ∶1（mL/g），超聲功率350 W，微波功率280 W，提取18 min，考察不同提取溫度對花色苷提取量的影響，如圖3所示。

圖3 提取溫度對花色苷提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of anthocyanin

由圖3可見，隨溫度的升高，花色苷提取量逐漸增加后緩慢降低；當(dāng)溫度為50℃時，花色苷提取量達(dá)到最大，為774.7 mg/100 g。主要原因是，溫度較低時，溶液分子運(yùn)動速度較低，不利于花色苷物質(zhì)的溶出；溫度過高時會破壞花色苷的結(jié)構(gòu)，所以后續(xù)不再進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)。因此，確定花色苷最適提取溫度為50℃。

2.2.3 微波功率對花色苷提取量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù) 60%，液料比 35 ∶1（mL/g），超聲功率350 W，提取溫度50℃，提取18 min，考察不同微波功率對花色苷提取量的影響，如圖4所示。

圖4 微波功率對花色苷提取量的影響Fig.4 Effects of microwave power on the yield of anthocyanin

由圖4可見，隨微波功率逐漸增加，花色苷提取量首先呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)微波功率為280 W時，花色苷提取量達(dá)到最大值，為770.3 mg/100 g；微波功率繼續(xù)增加，花色苷提取量降低。主要原因是，微波功率較低時，系統(tǒng)能穩(wěn)定在花色苷的最適溫度，可以使玫瑰茄中的花色苷逐漸的溶出；當(dāng)微波功率過高時，系統(tǒng)溫度也會隨之升高，導(dǎo)致已經(jīng)溶出的花色苷結(jié)構(gòu)遭到破壞，使其變性，造成花色苷的損失。因此，本研究選取微波功率280 W。

2.2.4 提取時間對花色苷提取量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù) 60%，液料比 35 ∶1（mL/g），超聲功率350 W，微波功率280 W，提取溫度50℃，考察不同提取時間對花色苷提取量的影響，如圖5所示。

圖5 提取時間對花色苷提取量的影響Fig.5 Effects of extraction time on the yield of anthocyanin

由圖5可見，隨提取時間的延長，花色苷提取量先增加后降低。當(dāng)提取時間為18 min時，花色苷有最大提取量，為775.1 mg/100 g。主要原因是，提取時間較短，花色苷還未完全溶出。提取時間為18 min時，花色苷溶出達(dá)到飽和，但是隨著時間延長，微波長時間照射，花色苷會發(fā)生降解，降低其含量。因此，本研究選取提取時間為18 min。

2.2.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花色苷提取量的影響

液料比 35 ∶1（mL/g），微波功率 280 W，超聲功率350 W，提取溫度50℃，提取18 min，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對花色苷提取量的影響，如圖6所示。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花色苷提取量的影響Fig.6 Effects of ethanol concentration on the yield of anthocyanin

由圖6可見，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，玫瑰茄花色苷提取量先升高后降低；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，花色苷提取量達(dá)到最大，為770.3 mg/100 g。主要原因是，花色苷屬于水溶性物質(zhì)，乙醇體積分?jǐn)?shù)過低時，提取劑極性較大，利于糖類物質(zhì)的溶出，導(dǎo)致溶液變得粘稠，從而降低花色苷的溶出量；反之，提取劑極性過小，水溶性的花色苷與提取劑相容性較低，也會降低花色苷的溶出量。因此，本研究選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.2.6 液料比對花色苷提取量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲功率350 W，微波功率280 W，提取溫度50℃，提取18 min，考察不同料液比對花色苷提取量的影響，如圖7所示。

圖7 液料比對花色苷提取量的影響Fig.7 Effects of liquid/solid ratio on the yield of anthocyanin

由圖7可見，當(dāng)溶劑量過小時，提取出的花色苷含量較低，當(dāng)液料比為35∶1（mL/g）時，玫瑰茄花色苷提取量達(dá)到最大，為776.8 mg/100 g；溶劑量繼續(xù)增大，花色苷提取量明顯下降。主要原因是，溶劑量逐漸增加時，有利于玫瑰茄中的花色苷向溶液中擴(kuò)散；但溶劑量過大會削弱超聲波和微波的輔助效果，從而影響花色苷的溶出。因此，本研究選取料液比為35∶1（mL/g）。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，超聲功率超過一定值時，對花色苷提取量影響較?。惶崛囟鹊母淖儠绊懟ㄉ盏姆€(wěn)定性。故在固定超聲功率350 W，提取溫度50℃條件下，選取對玫瑰茄花色苷提取量影響顯著的微波功率、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比4個因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，試驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface test

2.3.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得玫瑰茄花色苷提取量（Y）對自變量微波功率（A）、提取時間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）、液料比（D）的二元多項(xiàng)回歸方程：花色苷提取量=+785.84-1.78A+1.76B-2.46C+4.48D+2.53AB+0.20AC-0.63AD-1.27BC-10.33BD-9.50CD-9.61A2-7.70B2-14.20C2-15.44D2。該方程各項(xiàng)系數(shù)絕對值的大小直接反映了各因素對響應(yīng)值的影響程度，系數(shù)的正、負(fù)反映了影響的方向[25]?；ㄉ仗崛×績?yōu)化方程二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值，可知方程代表拋物面開口向下，有極大值點(diǎn)，能進(jìn)行優(yōu)化分析。各因素對花色苷提取量影響順序?yàn)橐毫媳龋―）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）＞微波功率（A）＞提取時間（B）。對該模型進(jìn)行方差分析與回歸方程可信度分析，結(jié)果分別見表3與表4。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of the regression model

表4 回歸方程可信度分析Table 4 The credibility analysis of the regression equation

由表 3 可見，C、D、A2、B2、C2、D2對響應(yīng)面的影響達(dá)到極顯著水平，四因素兩兩交互項(xiàng) BD、CD（P＜0.000 1），說明時間和液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比的交互作用影響極顯著。從整體分析，模型P＜0.000 1，表明該二次多項(xiàng)回歸模型達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)P＞0.05不顯著，表明模型與實(shí)際情況擬合較好。R2=0.992 6，R2Adj=0.985 2，C.V.=0.19%，說明方程對試驗(yàn)擬合較好。

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

等高線圖可以直觀地反映兩變量交互作用的影響程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反[26]。根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面圖見圖8。

由表3可知，微波功率、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比均為影響玫瑰茄花色苷的主要因素，各因素之間的交互影響如圖8所示。微波功率與乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率與液料比、提取時間與乙醇體積分?jǐn)?shù)間的交互作用不顯著（圖8b、8c、8d）。圖8a顯示，當(dāng)時間較短時，微波功率對花色苷提取量的影響比較顯著，花色苷提取量隨著功率增加而增加。在時間為16 min～18 min階段，微波功率280 W～290 W時的響應(yīng)面坡面極陡且存在極值，二者交互作用顯著。時間與料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比間交互作用顯著，曲面圖呈橢圓形，如圖 8e、8f。

圖8 各因素交互作用對花色苷提取量的等高線和響應(yīng)面圖Fig.8 Contour and response surface plots for the effects of different factors on the extraction rate of anthocyanin

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

通過軟件分析確定玫瑰茄花色苷最佳提取工藝為微波功率278.95 W，提取時間17.95 min，乙醇體積分?jǐn)?shù) 58.45%，液料比 36.02 ∶1（mL/g），玫瑰茄花色苷的理論值為786.556 mg/100 g?？紤]實(shí)際可操作性，調(diào)整參數(shù)為微波功率279 W，提取時間18 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，液料比1∶36（mL/g）。此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，玫瑰茄花色苷提取量為787.56 mg/100 g。與理論值相近，響應(yīng)面法優(yōu)化該提取方法具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲-微波協(xié)同法提取玫瑰茄中花色苷最優(yōu)條件為超聲功率350 W，提取溫度50℃，微波功率279 W，提取時間18 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，液料比1∶36（mL/g），玫瑰茄花色苷提取量為787.56 mg/100 g。該提取方法溶劑消耗量小、易回收，作用時間短，花色苷溶出量大。