馬風偉，李瑩，潘成，曹森，張光文，王瑞，楊興成，鄧青芳

（1.貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽550005；2.貴州烏蒙騰菌業(yè)有限公司，貴州畢節(jié)551601；3.貴州師范大學(xué)貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室，貴州貴陽550001）

天麻（Rhizoma Gastrodiae）為蘭科植物天麻（Gastrodia elata Bl.，G.elata）的干燥塊莖。具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡(luò)的功效，臨床多用于治療小兒驚風、癲癇抽搐、破傷風、頭痛眩暈、手足不遂、肢體麻木、風濕痹痛等癥[1-3]。多糖是由醛糖或酮糖通過糖苷鍵聚合連接組成的生物大分子化合物。其功能除具有骨架結(jié)構(gòu)（如纖維素、殼聚糖）和儲存養(yǎng)分（如淀粉、糖原）外，有些多糖還具有特殊的生物活性[4-9]。天麻多糖是天麻的活性成分之一，不僅含量高，且具有增強免疫力、改善記憶、清除自由基、抗病毒、抗血壓等藥理作用[10-14]。隨著衛(wèi)生部將天麻列為藥食兩用品種，天麻保健功能方面的開發(fā)利用前景廣闊，因此加速天麻多糖的開發(fā)尤為重要[15-16]。

本試驗采用單因素試驗研究提取時間、提取溫度、液固比對多糖得率的影響，并結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)。最后應(yīng)用優(yōu)化的提取方案對不同采收期的貴州大方烏天麻中的多糖進行提取并進行含量測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

D-無水葡萄糖對照品：中國食品藥品檢定研究院，批號110833-201707；氯仿、濃硫酸、丙酮、無水乙醇、正丁醇、苯酚均為國產(chǎn)分析純：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

天麻藥材：購自貴州烏蒙騰菌業(yè)有限公司，并經(jīng)貴州師范大學(xué)陳華國教授鑒定為蘭科植物天麻的塊莖，樣本保存在貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貯存編號分別為：20180010、20180011、20180012。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2700紫外-可見分光光度計：日本島津制作所；FA1004電子分析天平：上海良平儀器儀表有限公司；HH-8數(shù)顯恒溫循環(huán)水浴鍋：上海梅香儀器有限公司；FD-1C-80真空冷凍干燥機：北京博醫(yī)康試驗儀器有限公司；GZX-9146MBE電熱鼓風干燥箱：上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SK7200H高頻臺式超聲波清洗器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 天麻粗多糖的制備

稱取干燥至恒重的天麻粉末（過60目篩）10.0 g，依次經(jīng)石油醚、無水乙醇50 mL回流脫脂、脫色素處理2次，每次60 min，藥渣揮干至無醇味，加水300 mL在80℃下提取2小時后過濾，濾液減壓濃縮至20 mL，加入Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1，體積比）10 mL以除去游離蛋白質(zhì)，重復(fù)7次，濾液加入無水乙醇使乙醇濃度達80%，靜置過夜，離心（3 000 r/min）過濾，濾渣用少量無水乙醇、丙酮洗滌，然后加蒸餾水溶解，冷凍干燥，即得天麻粗多糖。

1.3.2 天麻粗多糖中糖含量的測定

改良的硫酸-苯酚法[17-18]進行測定。

1.3.2.1 標準曲線的建立

取干燥至恒重（105℃，6 h）的D-無水葡萄糖標準品10 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。分別精密吸取 200、300、400、500、600、700 μL標準品溶液置于具塞試管中，分別加入蒸餾水使體積為1.0 mL，然后加入5%的苯酚溶液1.0 mL并迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后在室溫放置5 min后置沸水中加熱10 min，取出后流水冷卻至室溫；另取蒸餾水1.0 mL加入苯酚和硫酸，同上操作為空白對照。于490 nm波長下測定吸光度。以葡萄糖濃度c為橫坐標（X），吸光度值A(chǔ)為縱坐標（Y）繪制標準曲線。

1.3.2.2 樣品中多糖含量的測定

稱取天麻粗多糖10 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加水稀釋定容。吸取天麻粗多糖溶液1.0mL，然后按標準曲線制備項下方法操作，測定吸光度，用回歸方程計算天麻粗多糖中的糖濃度，并計算多糖含量。

1.3.3 天麻多糖得率的計算

天麻多糖得率的計算公式如下：

式中：W為天麻多糖得率，%；C為從回歸曲線中計算得出的糖濃度，mg/mL；V 為定容體積，mL；M1為天麻粗多糖質(zhì)量，mg；M2為天麻原料質(zhì)量，mg；M3為配制天麻粗多糖溶液時稱取的質(zhì)量，mg。

1.4 天麻多糖提取的單因素考察

1.4.1 液固比對天麻多糖得率的影響

稱取干燥的天麻粉末10.0 g，經(jīng)脫脂、脫色素處理后，按照液固比分別為 10∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50∶1（mL/g）加水提取，提取溫度為80℃，提取時間75 min，然后按照1.3.1試驗方法處理，并用硫酸-苯酚法測定糖含量，計算多糖得率。

1.4.2 提取溫度對天麻多糖得率的影響

稱取干燥的天麻粉末10.0 g，經(jīng)脫脂、脫色素處理后，液固比 30 ∶1（mL/g），提取溫度分別為 50、60、70、80、90℃，提取時間75 min，然后按照1.3.1操作，計算多糖得率。

1.4.3 提取時間對天麻多糖得率的影響

稱取干燥的天麻粉末10.0 g，經(jīng)脫脂、脫色素處理后，液固比 30∶1（mL/g），提取溫度 80℃，提取時間分別為 30、45、60、75、90 min，然后按照 1.3.1 操作，計算多糖得率。

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken的設(shè)計原理，稱取干燥的天麻粉末10.0 g，在單因素考察的基礎(chǔ)上，以液固比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）為自變量，以天麻多糖得率為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面法優(yōu)化試驗，其因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面法試驗的因素及水平Table 1 Factors and levels of the independent variables for response surface methodology

1.6 不同采收期烏天麻中多糖含量的測定

取不同采收期（立冬、冬至、立春）的大方烏天麻，干燥后粉碎過篩，然后按照1.5優(yōu)化的提取工藝參數(shù)制備天麻粗多糖，然后稱取天麻粗多糖粉末，按照1.3.2方法測定多糖含量，計算多糖得率。

1.7 統(tǒng)計分析

采用SPAW 18.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標準差表示。其中P＜0.05為統(tǒng)計性顯著差異，P＜0.01為統(tǒng)計性差異極為顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線與線性范圍

以葡萄糖濃度c為橫坐標（X），吸光度A為縱坐標（Y），繪制標準曲線，如圖1所示，回歸方程為：Y=10.838X-0.006 2，R2=0.998 5，說明葡萄糖標準品溶液在濃度為0.020 6 mg/mL～0.072 1 mg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Calibration curve obtained by glucose

2.2 單因素考察結(jié)果

2.2.1 液固比對天麻多糖得率的影響

在提取溫度為80℃，提取時間為75 min的條件下，不同液固比對天麻多糖得率的影響如圖2所示。

圖2 液固比對天麻多糖得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on polysaccharide extraction rate

由圖 2 可知，液固比在 10 ∶1（mL/g）～30 ∶1（mL/g）范圍內(nèi)，天麻多糖得率從17.46%快速增加到28.44%，而液固比在 30 ∶1（mL/g）～40 ∶1（mL/g）范圍內(nèi)時，多糖得率增加趨勢明顯放緩，這可能是隨著液固比的增加，天麻組織中的多糖被浸提完全，而在液固比為50 ∶1（mL/g），多糖得率為 28.23%，呈現(xiàn)下降趨勢，可能是液固比的增加，導(dǎo)致提取溶劑的體積增加，同時無水乙醇用量增加，在水提醇沉及純化過程中出現(xiàn)多糖損失增加，導(dǎo)致天麻多糖的得率出現(xiàn)下降。因此選擇液固比選為 30 ∶1（mL/g）。

2.2.2 提取溫度對天麻多糖得率的影響

在液固比為 30∶1（mL/g），提取時間為 75 min的條件下，不同提取溫度對天麻多糖得率的影響如圖3所示。

圖3 提取溫度對天麻多糖得率的影響Fig.3 Effect of temperature on polysaccharide extraction rate

由圖3可知，在溫度50℃～70℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，多糖得率增加顯著，當溫度為80℃時，天麻多糖得率達到最大值，繼續(xù)升高溫度，多糖得率開始下降，這可能是因為適當?shù)臏囟仍黾佑兄诙嗵欠肿拥臒崃W(xué)運動，促進其溶出，但過高的溫度會引起多糖分析的聚合或降解，使其溶解度改變。因此提取溫度選為80℃。

2.2.3 提取時間對天麻多糖得率的影響

在液固比為 30∶1（mL/g），提取溫度為 80 ℃時，研究不同提取時間對天麻多糖得率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時間對天麻多糖得率的影響Fig.4 Effect of time on polysaccharide extraction rate

由圖4可知，在30 min～60 min范圍內(nèi)，隨著提取時間的延長，多糖得率不斷增加；當提取時間在75 min時，多糖得率趨于穩(wěn)定，達到28.57%，繼續(xù)延長提取時間，多糖得率基本穩(wěn)定，這可能是在75 min后，提取液與天麻細胞內(nèi)的多糖濃度達到平衡。因此提取時間選為75 min。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面法試驗設(shè)計

在單因素考察結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.06軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，響應(yīng)面法試驗設(shè)計見表2，通過響應(yīng)面法擬合得到天麻多糖得率的二次多元回歸方程：Y=30.20+3.15×A-2.54×B-0.21×C+1.40×AB+3.55×AC-0.18×BC-4.41×A2-3.79×B2-3.19×C2，R2=0.975 0。

表2 響應(yīng)面法試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and the results for response surface methodology

續(xù)表2 響應(yīng)面法試驗設(shè)計與結(jié)果Continue table 2 Experimental design and the results for response surface methodology

方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 方差分析Table 3 Data of variance analysis

由表3可知，失擬項不顯著，表明所得方程的模擬成功，試驗值與預(yù)測值有很好的擬合度，可以采用該模擬方程對天麻多糖得率的提取工藝進行預(yù)測和優(yōu)化分析。液固比（A）和提取溫度（B）對天麻多糖得率的影響極為顯著（P＜0.01），二次項對多糖得率都呈現(xiàn)極顯著影響；液固比（A）與提取時間（C）對多糖得率具有極顯著影響。

2.3.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

液固比、提取溫度和提取時間3個因素的兩兩交互作用對天麻多糖得率影響的響應(yīng)面圖如圖5所示。

圖5 響應(yīng)面圖Fig.5 The response surface map

響應(yīng)面圖可以顯示各試驗因素的不同水平之間與響應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系，同時可以較直觀的獲取試驗設(shè)計中的最優(yōu)工藝參數(shù)。由圖5可以看出，液固比的坡面比提取時間要陡峭（圖5b），說明液固比對天麻多糖得率影響較大；提取溫度的坡面比提取時間要陡（圖5c），說明提取溫度對天麻多糖得率影響較大。通過對響應(yīng)面圖的陡峭程度分析，發(fā)現(xiàn)液固比與提取溫度對天麻多糖得率的影響最大，而提取時間對其影響較小，這與前述方差分析結(jié)果一致。由響應(yīng)面得出最佳提取工藝為：液固比 34∶1（mL/g）、提取溫度 77℃、提取時間78 min，在此提取條件下，天麻多糖的預(yù)測得率為31.14%。

2.3.3 驗證試驗

在響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳工藝條件下，進行3次驗證試驗，為使現(xiàn)實中更加便捷地進行試驗，將提取溫度設(shè)定為75℃，提取時間設(shè)定為80 min，結(jié)果顯示，天麻多糖得率為：30.88%，相對標準偏差為0.67%，實際值和預(yù)測值相差僅為0.26%，說明響應(yīng)面法優(yōu)化的提取工藝參數(shù)準確可行。

2.4 不同采收期貴州大方烏天麻中多糖含量的測定

采用優(yōu)化的最佳提取工藝條件，對不同采收期貴州大方烏天麻中的多糖進行提取，并進行含量測定，計算多糖得率，結(jié)果見表4。

表4 不同采收期烏天麻中的多糖得率（n=3）Table 4 Results of polysaccharides content determination of G.elata samples obtained from different harvest periods（n=3）

由表4可知，不同采收期烏天麻中多糖的得率差異顯著，其中冬至采收的烏天麻中多糖得率最高，最高達到32.2%，其次為立冬采收，而立春采收的烏天麻中多糖得率最低，最低為20.6%。同時發(fā)現(xiàn)，不同采收期烏天麻中的多糖得率均大于20%，表明在這一段時間內(nèi)采收均能保證天麻多糖的含量。

3 結(jié)論

本文采用響應(yīng)面法對天麻多糖的提取工藝進行優(yōu)化，確定最佳提取工藝為：液固比34∶1（mL/g）、提取溫度77°C、提取時間78 min，在此提取條件下，天麻多糖的預(yù)測得率為31.14%。通過驗證試驗發(fā)現(xiàn)天麻多糖得率為：30.88%，相對標準偏差為0.67%，實際值和預(yù)測值相差僅為0.26%，說明響應(yīng)面法優(yōu)化的提取工藝參數(shù)準確可行。最后采用優(yōu)化的多糖提取工藝對不同采收期的貴州大方烏天麻中的多糖進行提取及含量測定，發(fā)現(xiàn)不同采收期烏天麻中的多糖得率差異顯著，其中冬至采收的烏天麻中多糖得率最高，最高可達32.2%。本研究對天麻多糖的工業(yè)化提取及深度開發(fā)利用具有一定的參考價值。