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        玫瑰花多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

        2018-11-09 05:37:08梁啟超鄒玉龍張秀萍吳宜艷張朝立
        食品研究與開發(fā) 2018年22期
        關(guān)鍵詞:小鼠工藝血清

        梁啟超,鄒玉龍,張秀萍,吳宜艷,*,張朝立

        (1.牡丹江醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,黑龍江牡丹江157011;2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院 藥學(xué)部,黑龍江牡丹江157011)

        玫瑰花是薔薇科植物玫瑰Rosa rugosa Thunb.的初開放的花或干燥花蕾[1],在全球范圍內(nèi)廣泛種植,但多數(shù)分布于北半球,以中西歐,亞洲等國家為主;在我國的栽培歷史悠久,目前在全國各地均有種植。玫瑰花甘溫、微苦、無毒,具有利膽、預(yù)防心臟病、降血脂、抗菌等功效[2-6],是一種良好的食藥兩用及觀賞花卉,在化妝品、釀酒、制糖、糕點、制茶和飲料等行業(yè)廣泛應(yīng)用[7-9],這些工業(yè)生產(chǎn)過程中,產(chǎn)生了大量含有多糖的玫瑰花渣。多糖為玫瑰花的重要活性成分之一,具有抗氧化、清除自由基、降血糖等作用[10-12]。以往玫瑰花多糖提取工藝常采用單因素試驗和正交試驗,但是這些方法預(yù)測性不佳[13-14]。本研究以玫瑰多糖得率為指標,在單因素試驗考察基礎(chǔ)上,應(yīng)用星點設(shè)計-響應(yīng)面法建立玫瑰花多糖得率與提取溫度、提取時間和料液比3個因素的數(shù)學(xué)模型,優(yōu)化玫瑰花多糖提取工藝。采用紫外-可見光譜、紅外光譜掃描初步分析玫瑰花多糖結(jié)構(gòu),并進一步考察其體內(nèi)抗氧化活性,為玫瑰花資源充分利用提供一定的理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        玫瑰花:安徽漢楓中藥飲片公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px) 和丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒:南京建成生物工程研究所;D-無水葡萄糖、D-半乳糖:阿拉丁試劑公司;其他試劑國產(chǎn)分析純;昆明小白鼠(雌性,20 g~24 g):牡丹江醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

        旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(R-250型):上海申勝生物技術(shù)有限公司;高速冷凍離心機(L03GH型):鹽城市凱特實驗儀器有限公司;真空冷凍干燥機(FDS-1000型):東京理化器械株式會社;紫外可見分光光度計(Cary 300型)、紅外光譜儀(Scimitor 800型):美國瓦里安技術(shù)中國有限公司。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 玫瑰花多糖的提取工藝流程

        玫瑰花→粉碎(過40目篩)→石油醚脫脂(索氏提取,無水乙醇,各回流4 h)→真空室溫干燥→準確稱取經(jīng)處理的玫瑰花粉末2.0 g,置于錐形瓶中→在選定的不同條件下熱水提取玫瑰花多糖→提取液離心(3 500 r/min,10 min)→上清液經(jīng)除蛋白、脫色→醇沉→離心(3 500 r/min,10 min)得沉淀→冷凍干燥→得玫瑰花多糖。

        1.2.2 玫瑰花多糖含量測定

        采用苯酚-硫酸法測量玫瑰花多糖含量。精密稱取無水葡萄糖標準品20 mg,加水至250 mL容量瓶,搖勻,得標準品溶液。分別吸取 0、10、20、30、40、50 mL葡萄糖標準品溶液,加水稀釋至50 mL容量瓶。分別量取不同濃度葡萄糖溶液各2 mL置于具塞試管中,加入5%苯酚1 mL,5 mL濃硫酸,搖勻,90℃下20 min,冷卻至室溫,以0號管為參比,在490 nm處測定其吸光值。以葡萄糖濃度C(g/L)為橫坐標,吸光度A為縱坐標,得回歸方程為A=0.108 8C+0.006 4,R2=0.999 3。將

        1.2.1制得的玫瑰花多糖用雙蒸水至500 mL容量瓶,得玫瑰花多糖提取液。準確吸取玫瑰花多糖溶液2mL,測定玫瑰花多糖樣品吸光度,根據(jù)回歸方程求出多糖溶液濃度,計算玫瑰花多糖得率。

        1.2.3 玫瑰花多糖提取單因素試驗

        取預(yù)處理的玫瑰花粉末2.0 g,以雙蒸水為溶劑,考察提取溫度、提取時間和料液比對玫瑰花多糖提取率影響。按液料比 30 ∶1(mL/g),在溫度分別為 50、60、70、80、90、100 ℃提取 240 min,考察提取溫度對玫瑰花多糖提取率影響;在液料比30∶1(mL/g),提取溫度90 ℃水浴下,分別提取 60、120、180、240、300、360 min,考察提取時間對玫瑰花多糖提取率影響;提取溫度90 ℃,提取時間 240 min,分別考察液料比 15∶1、20∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1、40 ∶1(mL/g)時對玫瑰花多糖提取率的影響[15-16]。

        1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝試驗

        根據(jù)星點試驗設(shè)計原理,在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上,設(shè)計三因素五水平試驗[17-18],以玫瑰花多糖得率為指標作響應(yīng)面圖,優(yōu)化玫瑰花多糖最佳提取工藝,并對結(jié)果驗證。其因素水平編碼表見表1。

        表1 因素水平表Table 1 Table of factors and levels

        1.2.5 玫瑰花多糖結(jié)構(gòu)分析

        紫外光譜分析:將多糖樣品配成0.5 mg/mL的溶液,以蒸餾水為空白,用紫外分光光度計在200 nm~800 nm波長范圍掃描。

        紅外光譜分析:取1 mg~2 mg玫瑰花多糖,與一定量溴化鉀混合均勻,壓片后,上紅外光譜儀在波數(shù)為4 000 cm-1~400 cm-1波數(shù)下進行紅外掃描。

        1.2.6 玫瑰花多糖體內(nèi)抗氧化活性

        60只雌性小鼠,經(jīng)1周環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng),隨機分為6組:空白對照組,衰老模型組,VC陽性對照組,玫瑰花多糖高、中、低劑量組。除對空白對照組小鼠每天頸背部皮下注射等體積的生理鹽水外,其他5組均按每日頸背部皮下注射120 mg/kg劑量的D-半乳糖。與此同時,玫瑰多糖高、中、低劑量組分別以600、300、150 mg(/kg·d) 多糖灌胃給藥,VC陽性對照組以150 mg(/kg·d)灌胃給藥,空白對照組和衰老模型組小鼠灌胃相應(yīng)體積生理鹽水[19]。

        實驗第42天,所有小鼠停止藥物干預(yù),小鼠禁食不禁水24 h,以眼眶后靜脈叢采集血樣,4℃放置2 h后,離心(3 500 r/min,10 min)得血清,頸椎脫臼處死小鼠,取出肝臟清洗后用預(yù)冷pH 7.4的磷酸緩沖溶液組織勻漿,3 000 r/min離心10 min上清備用。按照試劑盒說明書分別測定血清及肝組織中SOD、GSH-Px活性及MDA水平。

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        優(yōu)化試驗均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標準誤差,試驗數(shù)據(jù)處理及分析采用Design-Expert 8.0.6軟件;抗氧化試驗采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析,數(shù)據(jù)以平均值±標準誤差表示,P<0.05為顯著性差異,P<0.01為極顯著性差異。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 玫瑰花多糖提取單因素試驗

        提取溫度、提取時間、液料比對玫瑰多糖提取率影響見圖1。

        從圖1a結(jié)果可知,在50℃~90℃隨提取溫度上升,玫瑰花多糖得率顯著增加,多糖得率最大值為90℃,溫度從90℃提高到100℃,多糖得率有所降低,所以較合適的提取溫度為90℃。圖1b給出不同提取時間對多糖提取率影響。由圖可知,隨著提取時間的增加,玫瑰花多糖得率不斷增加,在提取240 min達到了最大值,之后隨著提取時間增加多糖得率輕微下降,因此,提取時間最終選擇240 min為宜。由圖1c可知,液料比從 15 ∶1(mL/g)到 30 ∶1(mL/g)玫瑰花多糖得率隨液料比的增加而增加,30∶1(mL/g)時提取率最高,此條件下多糖基本提取完全,增大料液比對多糖得率增加較小,提取液料比選擇 30 ∶1(mL/g)。

        圖1 提取溫度、提取時間、液料比對玫瑰多糖提取率的影響Fig.1 Extraction temperature,time and liquid to solid ratio on extraction yield of RRPP

        2.2 瑰花多糖提取單因素試驗

        2.2.1 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

        玫瑰花多糖得率用Design-Expert軟件響應(yīng)面處理,以玫瑰花多糖提取得率為響應(yīng)值,對各影響因素進行二次回歸分析,得到回歸方程Y=1.37+0.14A+0.10B+0.057C+0.017 5AB-0.005AC-0.032 5BC-0.083A2-0.122B2-0.111C2。響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表2。方差分析結(jié)果見表3。

        方差分析顯示,F(xiàn)值=15.888,回歸模型顯著性P<0.000 1,表示回歸方差模型極顯著的,說明模型有意義。A、B、A2、B2、C2均有顯著差異(P<0.01),表明 3 個因素對玫瑰多糖的影響不是簡單線性關(guān)系,同時,失擬項P>0.05,即模型與試驗比較吻合。R2adj=0.875 6表明該模型能解釋87.56%的變化,相關(guān)系數(shù)R2=0.934 6,說明試驗實際值與預(yù)測值有很好的相關(guān)性,可以用方程對提取結(jié)果進行預(yù)測。

        表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface design and results

        表3 設(shè)計方差分析表Table 3 Analysis of variance of experimental results

        2.2.2 因素間相互作用

        因素相互作用對提取率影響的響應(yīng)面圖見圖2。

        圖2 因素相互作用對提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 The mutual effects of different factors on the extraction yield of RRPP

        各因素的響應(yīng)面分析圖,可直觀地反映各因素的交互作用對響應(yīng)值的影響,當A、B、C 3個因素取值較小時,響應(yīng)面曲線較陡,等高線密度較大,此時各因素對玫瑰花多糖提取率影響較為明顯,但A、B、C取值較大時,響應(yīng)面曲線較平緩,等高線密度較小,說明此時3個因素對多糖提取率影響較小,等高線反應(yīng)了各因素的相互作用,等高線越近乎于圓形表示因素相互作用越小,橢圓形表示相互作用較大,從等高線圖可以看出 BC>AB>AC。

        2.2.3 最佳工藝的驗證試驗

        通過Design Expert 8.0.6優(yōu)化,確定玫瑰花多糖提取的最佳工藝為:提取溫95.41℃,提取時間256.35min,液料比30.51∶1(mL/g),該條件下多糖預(yù)測提取率1.46%。考慮試驗的實際條件,確定實際最佳工藝為:提取溫度95℃,提取時間256 min,液料比 30∶1(mL/g),進行3組驗證性試驗,實際提取得率分別為1.43%、1.45%、1.42%,平均值為1.43%,與理論預(yù)測值相差很小,試驗證明預(yù)測值與實際值吻合性良好,說明星點設(shè)計響應(yīng)面法對多糖提取工藝的優(yōu)化方案可行。

        2.3 玫瑰花多糖結(jié)構(gòu)初步分析

        多糖溶液在200 nm~800 nm波長范圍內(nèi)的吸收曲線如圖3所示。

        圖3 玫瑰花多糖紫外吸收光圖譜圖Fig.3 Ultraviolet spectrum of Rosa rugosa petals polysaccharides

        由圖3可知,在260 nm和280 nm處未出現(xiàn)吸收峰,無其他雜質(zhì)峰,表明玫瑰花多糖不含核酸和蛋白質(zhì)等。玫瑰花多糖紅外光圖譜圖見圖4。

        圖4 玫瑰花多糖紅外光圖譜圖Fig.4 Infrared spectrum of Rosa rugosa petals polysaccharides

        由圖4可知,3 433 cm-1處左右出現(xiàn)寬而強的吸收峰是多糖的O-H伸縮振動,在2 928 cm-1處左右出現(xiàn)的強吸收峰是多糖的C-H伸縮振動,1 345 cm-1處的收峰為多糖的C-H彎曲振動,這些峰是多糖物質(zhì)的特征峰[20]。在1 748 cm-1和1 609 cm-1出現(xiàn)的吸收峰為C=O伸縮振動,表明多糖中含有糖醛酸[21]。在895 cm-1和878 cm-1處有吸收峰,表明玫瑰花多糖的糖苷鍵結(jié)構(gòu)為β-D型吡喃糖。

        2.4 玫瑰花多糖體內(nèi)抗氧化活性

        玫瑰花多糖對小鼠血清和肝臟SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響見表4。

        表4 玫瑰花多糖對小鼠血清和肝臟SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響Table 4 Effect of RRPS on the activities of SOD,GSH-Px and the level of MDA in serums and livers in aging mice

        由表4可知,與正常對照組比較,模型小鼠血清和肝臟中 SOD 及 GSH-Px活性明顯下降(P<0.01),MDA含量明顯增高,存在顯著性差異(P<0.01),表明D-半乳糖致衰老模型成功。與D-半乳糖致衰老模型組相比不同劑量玫瑰花多糖組,小鼠血清和肝臟SOD和GSH-Px酶的活性均顯著增加,MDA含量降低(P<0.01)。多糖高劑量組的小鼠血清中SOD、GSH-Px酶的活性和 MDA 含量為(220.41±18.23)U/mL、(276.74±22.14)U/mL 和(7.30±0.50)nmol/mL;多糖高劑量組的小鼠肝臟抗氧化酶(SOD、GSH-Px)的影響和MDA含量為 (244.43±16.12)U/mg、(281.23±21.06)U/mg 和(10.56±0.84)nmol/mg。與衰老模型組相比多糖高劑量組血清和肝組織的SOD活性分別提高了18.17%、20.30%;GSH-Px活性分別提高了33.89%、33.32%;MDA含量降低45.77%、39.72%。這些結(jié)果表明,玫瑰多糖可顯著提高小鼠血清和肝臟中抗氧化酶(SOD、GSH-Px)活性,明顯抑制小鼠血清和肝組織中MDA含量的增加,有效減輕氧化損傷,表現(xiàn)出很強的體內(nèi)抗氧化活性。

        3 結(jié)論

        采用響應(yīng)面法優(yōu)化的玫瑰花多糖的最佳提取工藝為:提取溫度95℃,提取時間256 min,液料比30∶1(mL/g),在此工藝條件下,多糖提取得率為1.46%。此優(yōu)化提取工藝參數(shù)準確、可行,在試驗范圍內(nèi)能較準確地預(yù)測玫瑰花多糖的得率,為玫瑰花多糖的提取工藝提供參考,為玫瑰花資源充分利用提供試驗依據(jù)。

        玫瑰多糖可以顯著提高小鼠血清和肝組織中內(nèi)源性抗氧化酶活性(SOD、GSH-Px),明顯抑制小鼠血清和肝組織中MDA含量的增加,有效減輕氧化損傷,表現(xiàn)出很強的抗氧化活性,是一種具有開發(fā)潛力的天然抗氧化劑。

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