梁啟超，鄒玉龍，張秀萍，吳宜艷，*，張朝立

（1.牡丹江醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，黑龍江牡丹江157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院 藥學(xué)部，黑龍江牡丹江157011）

玫瑰花是薔薇科植物玫瑰Rosa rugosa Thunb.的初開放的花或干燥花蕾[1]，在全球范圍內(nèi)廣泛種植，但多數(shù)分布于北半球，以中西歐，亞洲等國家為主；在我國的栽培歷史悠久，目前在全國各地均有種植。玫瑰花甘溫、微苦、無毒，具有利膽、預(yù)防心臟病、降血脂、抗菌等功效[2-6]，是一種良好的食藥兩用及觀賞花卉，在化妝品、釀酒、制糖、糕點、制茶和飲料等行業(yè)廣泛應(yīng)用[7-9]，這些工業(yè)生產(chǎn)過程中，產(chǎn)生了大量含有多糖的玫瑰花渣。多糖為玫瑰花的重要活性成分之一，具有抗氧化、清除自由基、降血糖等作用[10-12]。以往玫瑰花多糖提取工藝常采用單因素試驗和正交試驗，但是這些方法預(yù)測性不佳[13-14]。本研究以玫瑰多糖得率為指標，在單因素試驗考察基礎(chǔ)上，應(yīng)用星點設(shè)計-響應(yīng)面法建立玫瑰花多糖得率與提取溫度、提取時間和料液比3個因素的數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化玫瑰花多糖提取工藝。采用紫外-可見光譜、紅外光譜掃描初步分析玫瑰花多糖結(jié)構(gòu)，并進一步考察其體內(nèi)抗氧化活性，為玫瑰花資源充分利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玫瑰花：安徽漢楓中藥飲片公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px） 和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所；D-無水葡萄糖、D-半乳糖：阿拉丁試劑公司；其他試劑國產(chǎn)分析純；昆明小白鼠（雌性，20 g～24 g）：牡丹江醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（R-250型）：上海申勝生物技術(shù)有限公司；高速冷凍離心機（L03GH型）：鹽城市凱特實驗儀器有限公司；真空冷凍干燥機（FDS-1000型）：東京理化器械株式會社；紫外可見分光光度計（Cary 300型）、紅外光譜儀（Scimitor 800型）：美國瓦里安技術(shù)中國有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 玫瑰花多糖的提取工藝流程

玫瑰花→粉碎（過40目篩）→石油醚脫脂（索氏提取，無水乙醇，各回流4 h）→真空室溫干燥→準確稱取經(jīng)處理的玫瑰花粉末2.0 g，置于錐形瓶中→在選定的不同條件下熱水提取玫瑰花多糖→提取液離心（3 500 r/min，10 min）→上清液經(jīng)除蛋白、脫色→醇沉→離心（3 500 r/min，10 min）得沉淀→冷凍干燥→得玫瑰花多糖。

1.2.2 玫瑰花多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測量玫瑰花多糖含量。精密稱取無水葡萄糖標準品20 mg，加水至250 mL容量瓶，搖勻，得標準品溶液。分別吸取 0、10、20、30、40、50 mL葡萄糖標準品溶液，加水稀釋至50 mL容量瓶。分別量取不同濃度葡萄糖溶液各2 mL置于具塞試管中，加入5%苯酚1 mL，5 mL濃硫酸，搖勻，90℃下20 min，冷卻至室溫，以0號管為參比，在490 nm處測定其吸光值。以葡萄糖濃度C（g/L）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，得回歸方程為A=0.108 8C+0.006 4，R2=0.999 3。將

1.2.1制得的玫瑰花多糖用雙蒸水至500 mL容量瓶，得玫瑰花多糖提取液。準確吸取玫瑰花多糖溶液2mL，測定玫瑰花多糖樣品吸光度，根據(jù)回歸方程求出多糖溶液濃度，計算玫瑰花多糖得率。

1.2.3 玫瑰花多糖提取單因素試驗

取預(yù)處理的玫瑰花粉末2.0 g，以雙蒸水為溶劑，考察提取溫度、提取時間和料液比對玫瑰花多糖提取率影響。按液料比 30 ∶1（mL/g），在溫度分別為 50、60、70、80、90、100 ℃提取 240 min，考察提取溫度對玫瑰花多糖提取率影響；在液料比30∶1（mL/g），提取溫度90 ℃水浴下，分別提取 60、120、180、240、300、360 min，考察提取時間對玫瑰花多糖提取率影響；提取溫度90 ℃，提取時間 240 min，分別考察液料比 15∶1、20∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1、40 ∶1（mL/g）時對玫瑰花多糖提取率的影響[15-16]。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝試驗

根據(jù)星點試驗設(shè)計原理，在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，設(shè)計三因素五水平試驗[17-18]，以玫瑰花多糖得率為指標作響應(yīng)面圖，優(yōu)化玫瑰花多糖最佳提取工藝，并對結(jié)果驗證。其因素水平編碼表見表1。

表1 因素水平表Table 1 Table of factors and levels

1.2.5 玫瑰花多糖結(jié)構(gòu)分析

紫外光譜分析：將多糖樣品配成0.5 mg/mL的溶液，以蒸餾水為空白，用紫外分光光度計在200 nm～800 nm波長范圍掃描。

紅外光譜分析：取1 mg～2 mg玫瑰花多糖，與一定量溴化鉀混合均勻，壓片后，上紅外光譜儀在波數(shù)為4 000 cm-1～400 cm-1波數(shù)下進行紅外掃描。

1.2.6 玫瑰花多糖體內(nèi)抗氧化活性

60只雌性小鼠，經(jīng)1周環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)，隨機分為6組：空白對照組，衰老模型組，VC陽性對照組，玫瑰花多糖高、中、低劑量組。除對空白對照組小鼠每天頸背部皮下注射等體積的生理鹽水外，其他5組均按每日頸背部皮下注射120 mg/kg劑量的D-半乳糖。與此同時，玫瑰多糖高、中、低劑量組分別以600、300、150 mg（/kg·d） 多糖灌胃給藥，VC陽性對照組以150 mg（/kg·d）灌胃給藥，空白對照組和衰老模型組小鼠灌胃相應(yīng)體積生理鹽水[19]。

實驗第42天，所有小鼠停止藥物干預(yù)，小鼠禁食不禁水24 h，以眼眶后靜脈叢采集血樣，4℃放置2 h后，離心（3 500 r/min，10 min）得血清，頸椎脫臼處死小鼠，取出肝臟清洗后用預(yù)冷pH 7.4的磷酸緩沖溶液組織勻漿，3 000 r/min離心10 min上清備用。按照試劑盒說明書分別測定血清及肝組織中SOD、GSH-Px活性及MDA水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

優(yōu)化試驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標準誤差，試驗數(shù)據(jù)處理及分析采用Design-Expert 8.0.6軟件；抗氧化試驗采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤差表示，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰花多糖提取單因素試驗

提取溫度、提取時間、液料比對玫瑰多糖提取率影響見圖1。

從圖1a結(jié)果可知，在50℃～90℃隨提取溫度上升，玫瑰花多糖得率顯著增加，多糖得率最大值為90℃，溫度從90℃提高到100℃，多糖得率有所降低，所以較合適的提取溫度為90℃。圖1b給出不同提取時間對多糖提取率影響。由圖可知，隨著提取時間的增加，玫瑰花多糖得率不斷增加，在提取240 min達到了最大值，之后隨著提取時間增加多糖得率輕微下降，因此，提取時間最終選擇240 min為宜。由圖1c可知，液料比從 15 ∶1（mL/g）到 30 ∶1（mL/g）玫瑰花多糖得率隨液料比的增加而增加，30∶1（mL/g）時提取率最高，此條件下多糖基本提取完全，增大料液比對多糖得率增加較小，提取液料比選擇 30 ∶1（mL/g）。

圖1 提取溫度、提取時間、液料比對玫瑰多糖提取率的影響Fig.1 Extraction temperature，time and liquid to solid ratio on extraction yield of RRPP

2.2 瑰花多糖提取單因素試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

玫瑰花多糖得率用Design-Expert軟件響應(yīng)面處理，以玫瑰花多糖提取得率為響應(yīng)值，對各影響因素進行二次回歸分析，得到回歸方程Y=1.37+0.14A+0.10B+0.057C+0.017 5AB-0.005AC-0.032 5BC-0.083A2-0.122B2-0.111C2。響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表2。方差分析結(jié)果見表3。

方差分析顯示，F(xiàn)值=15.888，回歸模型顯著性P＜0.000 1，表示回歸方差模型極顯著的，說明模型有意義。A、B、A2、B2、C2均有顯著差異（P＜0.01），表明 3 個因素對玫瑰多糖的影響不是簡單線性關(guān)系，同時，失擬項P＞0.05，即模型與試驗比較吻合。R2adj=0.875 6表明該模型能解釋87.56%的變化，相關(guān)系數(shù)R2=0.934 6，說明試驗實際值與預(yù)測值有很好的相關(guān)性，可以用方程對提取結(jié)果進行預(yù)測。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface design and results

表3 設(shè)計方差分析表Table 3 Analysis of variance of experimental results

2.2.2 因素間相互作用

因素相互作用對提取率影響的響應(yīng)面圖見圖2。

圖2 因素相互作用對提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 The mutual effects of different factors on the extraction yield of RRPP

各因素的響應(yīng)面分析圖，可直觀地反映各因素的交互作用對響應(yīng)值的影響，當A、B、C 3個因素取值較小時，響應(yīng)面曲線較陡，等高線密度較大，此時各因素對玫瑰花多糖提取率影響較為明顯，但A、B、C取值較大時，響應(yīng)面曲線較平緩，等高線密度較小，說明此時3個因素對多糖提取率影響較小，等高線反應(yīng)了各因素的相互作用，等高線越近乎于圓形表示因素相互作用越小，橢圓形表示相互作用較大，從等高線圖可以看出 BC＞AB＞AC。

2.2.3 最佳工藝的驗證試驗

通過Design Expert 8.0.6優(yōu)化，確定玫瑰花多糖提取的最佳工藝為：提取溫95.41℃，提取時間256.35min，液料比30.51∶1（mL/g），該條件下多糖預(yù)測提取率1.46%。考慮試驗的實際條件，確定實際最佳工藝為：提取溫度95℃，提取時間256 min，液料比 30∶1（mL/g），進行3組驗證性試驗，實際提取得率分別為1.43%、1.45%、1.42%，平均值為1.43%，與理論預(yù)測值相差很小，試驗證明預(yù)測值與實際值吻合性良好，說明星點設(shè)計響應(yīng)面法對多糖提取工藝的優(yōu)化方案可行。

2.3 玫瑰花多糖結(jié)構(gòu)初步分析

多糖溶液在200 nm～800 nm波長范圍內(nèi)的吸收曲線如圖3所示。

圖3 玫瑰花多糖紫外吸收光圖譜圖Fig.3 Ultraviolet spectrum of Rosa rugosa petals polysaccharides

由圖3可知，在260 nm和280 nm處未出現(xiàn)吸收峰，無其他雜質(zhì)峰，表明玫瑰花多糖不含核酸和蛋白質(zhì)等。玫瑰花多糖紅外光圖譜圖見圖4。

圖4 玫瑰花多糖紅外光圖譜圖Fig.4 Infrared spectrum of Rosa rugosa petals polysaccharides

由圖4可知，3 433 cm-1處左右出現(xiàn)寬而強的吸收峰是多糖的O-H伸縮振動，在2 928 cm-1處左右出現(xiàn)的強吸收峰是多糖的C-H伸縮振動，1 345 cm-1處的收峰為多糖的C-H彎曲振動，這些峰是多糖物質(zhì)的特征峰[20]。在1 748 cm-1和1 609 cm-1出現(xiàn)的吸收峰為C=O伸縮振動，表明多糖中含有糖醛酸[21]。在895 cm-1和878 cm-1處有吸收峰，表明玫瑰花多糖的糖苷鍵結(jié)構(gòu)為β-D型吡喃糖。

2.4 玫瑰花多糖體內(nèi)抗氧化活性

玫瑰花多糖對小鼠血清和肝臟SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響見表4。

表4 玫瑰花多糖對小鼠血清和肝臟SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響Table 4 Effect of RRPS on the activities of SOD，GSH-Px and the level of MDA in serums and livers in aging mice

由表4可知，與正常對照組比較，模型小鼠血清和肝臟中 SOD 及 GSH-Px活性明顯下降（P＜0.01），MDA含量明顯增高，存在顯著性差異（P＜0.01），表明D-半乳糖致衰老模型成功。與D-半乳糖致衰老模型組相比不同劑量玫瑰花多糖組，小鼠血清和肝臟SOD和GSH-Px酶的活性均顯著增加，MDA含量降低（P＜0.01）。多糖高劑量組的小鼠血清中SOD、GSH-Px酶的活性和 MDA 含量為（220.41±18.23）U/mL、（276.74±22.14）U/mL 和（7.30±0.50）nmol/mL；多糖高劑量組的小鼠肝臟抗氧化酶（SOD、GSH-Px）的影響和MDA含量為 （244.43±16.12）U/mg、（281.23±21.06）U/mg 和（10.56±0.84）nmol/mg。與衰老模型組相比多糖高劑量組血清和肝組織的SOD活性分別提高了18.17%、20.30%；GSH-Px活性分別提高了33.89%、33.32%；MDA含量降低45.77%、39.72%。這些結(jié)果表明，玫瑰多糖可顯著提高小鼠血清和肝臟中抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活性，明顯抑制小鼠血清和肝組織中MDA含量的增加，有效減輕氧化損傷，表現(xiàn)出很強的體內(nèi)抗氧化活性。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化的玫瑰花多糖的最佳提取工藝為：提取溫度95℃，提取時間256 min，液料比30∶1（mL/g），在此工藝條件下，多糖提取得率為1.46%。此優(yōu)化提取工藝參數(shù)準確、可行，在試驗范圍內(nèi)能較準確地預(yù)測玫瑰花多糖的得率，為玫瑰花多糖的提取工藝提供參考，為玫瑰花資源充分利用提供試驗依據(jù)。

玫瑰多糖可以顯著提高小鼠血清和肝組織中內(nèi)源性抗氧化酶活性（SOD、GSH-Px），明顯抑制小鼠血清和肝組織中MDA含量的增加，有效減輕氧化損傷，表現(xiàn)出很強的抗氧化活性，是一種具有開發(fā)潛力的天然抗氧化劑。