BARANYIKA Jean Baptiste，馬曉燕，王慧慧，F(xiàn)IDINIAINA Rina Juliana，蒲首丞，孫梅好

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

植物內(nèi)生菌是指那些在植物一生中的某個(gè)階段或全部階段，能夠進(jìn)入植物的組織和器官內(nèi)部，與植物共同生存，且不會(huì)引發(fā)植物組織變化的真菌或細(xì)菌。但也可能由于植物自身衰老或一些外界條件刺激，內(nèi)生菌導(dǎo)致植物免疫力下降，進(jìn)而產(chǎn)生一些病癥[1-3]。內(nèi)生細(xì)菌與植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，形成了一種互利共生的關(guān)系，而且有助于植物抵抗惡劣環(huán)境，提高植物的生存能力[4]。內(nèi)生細(xì)菌與根際細(xì)菌相比，其生存能力更強(qiáng)，抵御一些生物脅迫和非生物脅迫的能力也要強(qiáng)，而且有助于植物對(duì)難降解物的降解，有助于生物防治[5-6]。除此之外，植物內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)有穩(wěn)定的生存空間，較難受外界環(huán)境的影響[7-8]。而且有關(guān)植物內(nèi)生細(xì)菌在生防、促生以及固氮作用方面進(jìn)行了大量研究，證明其有利于生物防治[9-13]。植物內(nèi)生細(xì)菌內(nèi)有很多植物病原菌的拮抗菌株，而且不同植物種類不同[14-18]。

菌株的生長(zhǎng)受許多因素影響，如培養(yǎng)基的pH、溫度、接種量和種齡等。為了提高其生長(zhǎng)速度，縮短培養(yǎng)時(shí)間，本試驗(yàn)選取培養(yǎng)時(shí)間、溫度、pH和接種量進(jìn)行單因素試驗(yàn)來(lái)確定菌株的最佳生長(zhǎng)條件，再由單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇3個(gè)影響較大的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果獲得更優(yōu)化的生長(zhǎng)條件，從而通過(guò)最優(yōu)的條件培養(yǎng)，獲得JX-3菌株的最大生長(zhǎng)量。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株為銀杏內(nèi)生細(xì)菌JX-3。將銀杏葉外表面清洗消毒、磨碎，然后涂布于NA固體培養(yǎng)基上，進(jìn)而挑選單菌落，將其命名為JX-3。

NA培養(yǎng)基為胰蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，蔗糖10 g，牛肉膏3 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 制備種子液 將活化好的JX-3菌液吸取2 mL加到裝有100 mL的NA培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，即為JX-3的種子液（OD560值在0.4～0.8即可）。

1.2.2 氯化鋁反應(yīng) 用移液槍吸取JX-3種子液50 μL點(diǎn)在無(wú)菌濾紙上，再對(duì)著該點(diǎn)噴灑少量2%的AlCl3乙醇溶液，吹風(fēng)機(jī)吹干后置于紫外燈下觀察。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 按照接種量、培養(yǎng)基的pH、溫度和培養(yǎng)時(shí)間4個(gè)條件對(duì)JX-3菌株的生長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定菌液的OD值。

設(shè)置 5 個(gè)培養(yǎng)時(shí)間，分別為 1，2，3，4，5 h，將培養(yǎng)的種子液接種于NA液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，總體積為5 mL/管，然后置于30℃，220 r/min搖床中振動(dòng)培養(yǎng)，分別測(cè)定其吸光度（OD560）。

設(shè)置 5 個(gè)溫度梯度，分別為 40，35，30，25，20℃，接種種子液于NA液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，總體積為5mL/管（4 mL NA液體和1 mL種子液），置于相應(yīng)溫度、220 r/min搖床中振動(dòng)培養(yǎng)3 h，分別測(cè)定其吸光度（OD560）。

設(shè)置 5 個(gè) pH 值，即 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，將種子液接種于NA液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，總體積為5 mL/管，置于30℃，220 r/min搖床中振動(dòng)培養(yǎng)3 h，分別測(cè)定其吸光度（OD560）。

設(shè)置7個(gè)接種量，即16%，14%，12%，10%，8%，6%，4%，將培養(yǎng)的種子液接種于NA液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，總體積為5 mL/管，然后置于30℃，220 r/min搖床中振動(dòng)培養(yǎng)3 h，分別測(cè)定其吸光度（OD560）。

1.2.4 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置正交試驗(yàn)表，選擇時(shí)間、接種量和溫度這3個(gè)因素分別做3組水平重復(fù)。按照設(shè)置的細(xì)菌JX-3正交試驗(yàn)表接種到試管中，每管總體積為5 mL，于220 r/min對(duì)應(yīng)正交溫度下振蕩培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間，并分別測(cè)定其吸光度（OD560）。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯化鋁反應(yīng)結(jié)果分析

氯化鋁反應(yīng)發(fā)現(xiàn)有黃綠色熒光出現(xiàn)，說(shuō)明樣品中可能含有黃酮類化合物，即JX-3菌株可以產(chǎn)黃酮類化合物。

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)JX-3菌體生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，培養(yǎng)時(shí)間為4 h時(shí)，所獲得菌液的OD值最大，為0.843，說(shuō)明培養(yǎng)時(shí)間為4 h時(shí)內(nèi)生菌JX-3的生長(zhǎng)效果最好。

2.3 不同溫度對(duì)JX-3菌體生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，當(dāng)溫度為35℃時(shí)，所獲得菌液的OD值最大，為0.779，說(shuō)明35℃時(shí)內(nèi)生菌JX-3的生長(zhǎng)效果最好。

2.4 不同pH值對(duì)JX-3菌體生長(zhǎng)的影響

從圖3可以看出，當(dāng)pH值為7.0時(shí)，所獲得菌液的OD值最大，為0.694，說(shuō)明在pH值7.0時(shí)內(nèi)生菌JX-3的生長(zhǎng)效果最好。

2.5 不同接種量對(duì)JX-3菌體生長(zhǎng)的影響

從圖4可以看出，接種量為12%時(shí)，所獲得菌液的OD值最大，為0.635，說(shuō)明接種量為12%時(shí)內(nèi)生菌JX-3的生長(zhǎng)效果最好。

2.6 正交優(yōu)化試驗(yàn)

由表1可知，細(xì)菌JX-3的R值排序?yàn)椋簳r(shí)間＞pH＞接種量，所以，JX-3的最佳生長(zhǎng)條件為：培養(yǎng)時(shí)間5 h，pH值7.0，接種量8%。

表1 銀杏內(nèi)生細(xì)菌JX-3生長(zhǎng)的正交試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

銀杏內(nèi)生細(xì)菌對(duì)銀杏的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的作用，本試驗(yàn)獲得了銀杏內(nèi)生細(xì)菌JX-3的最優(yōu)生長(zhǎng)溫度、pH和接種量。關(guān)于內(nèi)生細(xì)菌與植物之間的互利關(guān)系還需要更深入的研究，更清楚準(zhǔn)確的機(jī)制進(jìn)而解釋這種關(guān)系。