劉恩強(qiáng)，陳果，廖修用，許美鳳，魏貴玉，羅小平

肝纖維化的病理機(jī)制為肝組織膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解失衡，導(dǎo)致膠原纖維沉積[1，2]。肝纖維化為肝硬化的必經(jīng)階段，并可能發(fā)展為肝癌[3，4]。大量研究表明，肝星狀細(xì)胞的活化為肝纖維化的關(guān)鍵步驟，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1/Smad通路和ERK通路對(duì)肝星狀細(xì)胞活化具有調(diào)節(jié)作用[5，6]。本課題組前期研究證明，蝦青素對(duì)大鼠肝纖維化過(guò)程具有抑制作用，但其抑制機(jī)制并未明確。本研究探討了蝦青素是否通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad通路或ERK通路抑制了肝纖維化的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物喂養(yǎng)及處理均符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)》的相關(guān)規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。蝦青素（astaxanthin，阿拉?。┖颓锼蓧A（吉林紫鑫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào) 110809）；四氯化碳（CCl4，淄博暢榮化工，批號(hào)120708）；兔抗鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、抗Ⅰ型膠原（collagenⅠ）、抗Smad2單克隆抗體（美國(guó)，Abcam 公司，批號(hào)為 ab224492、ab80424、Q16795 和G3507）；蘇木精-伊紅（HE）染色液（北京索萊寶）；10%甲醛固定液（上海歌凡）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo公司）。低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；光學(xué)顯微鏡（日本 OLYMPUS公司）；Line Gene9600實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（北京中科盟科技有限公司）；DYCZ-40K電泳儀、DYCZ-40G電泳槽和DYCZ轉(zhuǎn)模儀（北京六一儀器廠）。

1.2 模型制備[7]將SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、秋水仙堿組（0.1 mg·kg-1）、蝦青素Ⅰ組（2 mg·kg-1）和蝦青素Ⅱ組（4 mg·kg-1），每組 10 只。除正常組外，其余各組經(jīng)大鼠背部皮下注射50%CCl4（1.0 ml·kg-1），每周 2次，持續(xù) 10 w。給予正常組同等劑量的花生油，在造模后第6 w，分別給予各組大鼠相應(yīng)藥物灌胃，1次/d，共6 w。在最后一次灌胃后，禁食12 h，處死動(dòng)物。取肝組織，置于10%甲醛溶液中固定后切片，行HE和馬松（Masson）染色，光鏡下觀察肝組織損傷和膠原纖維增生程度。采用Metavir分級(jí)法評(píng)價(jià)肝纖維化分期（S1～S4）[8]。

1.3 大鼠肝組織 CollagenⅠ、Smad2、TGF-β1 和p-ERK蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法，取適量大鼠肝組織，加Trizol裂解液和PMSE（100:1）裂解肝組織35 min，4℃ 4000 r/m離心20 min。取上清液，置于-20℃冰箱保存。采用BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度。使用Image J軟件測(cè)定條帶IOD值。

1.4 大鼠肝組織 CollagenⅠ、Smad2、TGF-β1 和p-ERK mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法，用液氮研磨肝臟組織，加入Trizol溶液提取總RNA。經(jīng)核酸蛋白儀和瓊脂糖電泳對(duì)提取的RNA進(jìn)行分析。取總RNA 4 μL，82℃水浴5 min，加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，44℃孵育60 min，留取產(chǎn)物待測(cè)。擴(kuò)增參數(shù)，95℃10 min，60℃50 s,72℃延伸 50 s，72℃最終延伸 10 min，10℃最終保存?；蛩椒治霾捎?-△Ct法測(cè)定相對(duì)含量，將β-actin設(shè)為內(nèi)參，取Ct值。計(jì)算公式為△Ct=Ct（目的基因）-Ct（β-actin）。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，對(duì)服從正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比價(jià)采用LSD-t檢驗(yàn)。等級(jí)資料的比較采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝纖維化分期比較 與模型組比，應(yīng)用蝦青素干預(yù)后，肝纖維化S3期減少，S2期增多（表2），但兩種劑量的蝦青素干預(yù)組無(wú)顯著性相差（P＞0.05）。

表2 各組大鼠肝纖維化分期（%）比較

2.2 各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化 在光學(xué)顯微鏡下觀察可見，正常組大鼠肝組織無(wú)明顯異常,其結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞膜清晰，核仁明顯且細(xì)胞質(zhì)豐富，無(wú)膠原纖維增生沉積；模型組大鼠肝組織出現(xiàn)大面積脂肪變性，多數(shù)細(xì)胞核消失，纖維增生明顯；與模型組比，蝦青素Ⅰ組和蝦青素Ⅱ組大鼠肝組織損傷表現(xiàn)呈好轉(zhuǎn)趨勢(shì)，大劑量蝦青素處理組表現(xiàn)更明顯（圖1）。Masson染色觀察，有少量細(xì)小的藍(lán)色膠原纖維出現(xiàn)在正常大鼠肝組織匯管區(qū)周圍，未見纖維增生，而在模型組大鼠，見肝組織大量膠原纖維增生，形成粗大的纖維間隔，將肝小葉分隔成大小不等的假小葉；給予蝦青素和秋水仙堿干預(yù)后，肝組織膠原纖維增生明顯減少（圖2）。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE，200×）

圖2 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（Masson，200×）

表3 各組大鼠肝組織蛋白表達(dá)（±s）比較

表3 各組大鼠肝組織蛋白表達(dá)（±s）比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

只 CollagenⅠ TGF-β1 Smad2 p-ERK正常組 10 0.4±0.1 0.5±0.1 0.5±0.1 0.4±0.1模型組 10 1.7±0.4① 1.7±0.4① 1.6±0.3① 1.6±0.5①蝦青素Ⅰ組 10 1.4±0.3①② 1.4±0.4①② 1.3±0.4①② 1.2±0.4①②蝦青素Ⅱ組 10 1.2±0.3①② 1.2±0.3①② 0.8±0.4①② 0.9±0.3①②秋水仙堿組 10 0.4±0.1② 0.6±0.1② 0.5±0.1② 0.5±0.1②

2.3 各組大鼠肝組織CollagenⅠ、Smad2、TGF-β1和p-ERK蛋白表達(dá)的變化 與正常組比較，模型組肝組織CollagenⅠ、Smad2、TGF-β1和p-ERK蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比，蝦青素Ⅰ組、蝦青素Ⅱ組和秋水仙堿組大鼠肝組織四種蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05，表 3、圖 3～6）。

2.4 各組大鼠肝組織CollagenⅠ、Smad2、TGF-β1和p-ERK mRNA水平變化 與正常組比，模型組大鼠肝組織CollagenⅠ、Smad2、TGF-β1和p-ERK mRNA水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比，蝦青素Ⅰ組、蝦青素Ⅱ組大鼠肝組織CollagenⅠ、Smad2、TGF-β1和 p-ERK mRNA 水平顯著降低（P＜0.05），且隨著劑量的增加，下降更明顯（P＜0.05，表 4、圖 7）。

圖3 各組大鼠肝組織CollagenⅠ蛋白表達(dá)的變化（免疫組化，200×）

圖4 各組大鼠肝組織Smad2蛋白表達(dá)的變化（免疫組化，200×）

圖5 各組大鼠肝組織TGF-β1蛋白表達(dá)的變化（免疫組化，200×）

圖6 各組大鼠肝組織p-ERK蛋白表達(dá)的變化（免疫組化，200×）

表4 四組大鼠肝組織蛋白基因（m RNA）水平（±s）比較

表4 四組大鼠肝組織蛋白基因（m RNA）水平（±s）比較

與正常組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

只 CollagenⅠ TGF-β1 Smad2 p-ERK正常組 10 1.0±0.1 1.0±0.1 1.0±0.1 1.1±0.1模型組 10 2.4±0.4① 2.5±0.5① 2.5±0.6① 2.6±0.5①蝦青素Ⅰ組 10 2.0±0.4①② 2.1±0.4①② 2.0±0.5①② 2.1±0.4①②蝦青素Ⅱ組 10 1.8±0.5①② 1.6±0.3①② 1.8±0.4①② 1.8±0.3①②秋水仙堿組 10 1.1±0.1② 1.2±0.1② 1.1±0.1② 1.1±0.1②

圖7 各組大鼠肝組織蛋白基因（mRNA）水平變化

3 討論

本研究通過(guò)注射四氯化碳制備肝纖維化大鼠模型，觀察了蝦青素干預(yù)對(duì)大鼠肝纖維化的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同劑量的蝦青素干預(yù)大鼠6周后，肝組織膠原纖維增生程度降低，大鼠肝纖維化程度明顯減輕，提示蝦青素對(duì)肝纖維化進(jìn)程具有抑制作用。

已有研究指出，肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞的活化[9-11]。ERK通路與肝星狀細(xì)胞的功能關(guān)系密切，參與了肝纖維化進(jìn)程的調(diào)節(jié)。在四氯化碳所致的肝纖維化大鼠，肝組織ERK基因表達(dá)明顯增強(qiáng)[12，13]。應(yīng)用MEK抑制劑處理大鼠后，ERK活性降低，且肝星狀細(xì)胞的增殖也受到明顯的抑制[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蝦青素處理組大鼠肝組織p-ERK蛋白及其mRNA水平均呈下降趨勢(shì)，并隨著蝦青素劑量的加大變得明顯，提示蝦青素對(duì)肝纖維化大鼠的保護(hù)作用可能與抑制ERK通路有關(guān)。

在肝星狀細(xì)胞活化后，合成細(xì)胞外基質(zhì)增多，Ⅰ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積增多[15，16]。TGF-β1/Smad信號(hào)通路在肝星狀細(xì)胞活化過(guò)程具有重要作用。TGF-β1具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化及細(xì)胞外基質(zhì)合成分泌作用，Smad蛋白為TGF-β的受體后蛋白，在肝纖維化信號(hào)通路中起到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[17，18]。TGF-β1/Smad 信號(hào)通路在致病因子的刺激下，表達(dá)增多，引起肝纖維化的形成。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Smad基因片段的缺失可對(duì)肝纖維化起到抑制作用[19]。本研究結(jié)果顯示，蝦青素能夠顯著下調(diào)Smad、Ⅰ型膠原和TGF-β1表達(dá)，減輕肝損傷，延緩肝纖維化進(jìn)程。