姜哲，舒敏，王媛媛，樸蓮淑

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）是源于肝細胞和肝內膽管上皮細胞的惡性腫瘤，其中肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）超過 90%，肝內膽管細胞癌約占4%左右，極少數(shù)為肝細胞癌-肝內膽管細胞混合癌[1，2]。全球每年有超過60萬人死于 PLC，其中50%發(fā)生在中國，且其死亡率一直呈上升趨勢[3]。目前，治療肝癌的有效方法是手術切除、肝移植和輔助放化療，但大部分肝癌患者首診時已為晚期，超過50%HCC患者在接受肝切除術后出現(xiàn)腫瘤復發(fā)[4]。因此，早期診斷和治療 HCC，對提高患者手術療效以及延長生存期具有重要的意義。采用經(jīng)皮穿刺肝動脈栓塞和生物治療等干預方法治療 HCC復發(fā)和轉移也一直廣受關注，但這些方法治療的效果還有待提高[5，6]。探討 HCC發(fā)生侵襲轉移的分子機制，對 HCC的診斷、治療和預后具有重要的意義。近年來，非編碼小分子RNA在HCC侵襲轉移中的作用受到研究者的關注。非編碼小分子RNA可以從多個層面調控基因的轉錄和表達，參與機體各種生理病理機制的調控，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，對微小核糖核酸（microRNA，miRNA）的研究較為深入。miRNA是一類調控蛋白質編碼基因的內源性非編碼RNAs，長度為21個核苷酸左右，在真核生物中存在，參與細胞分化、細胞增殖和凋亡等各個過程，也參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[7，8]。miR-363是新近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，在肝癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌和胃癌等癌組織表達上調，降低miR-363表達能夠抑制細胞增殖，但其具體機制還不清楚[9]。研究表明，E2F轉錄因子3（E2F3）在肝癌細胞高表達，且與 HCC發(fā)生密切相關[10]。本研究探討了miR-363靶向調控HepG2細胞E2F3表達對肝癌細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器 肝癌細胞HepG2細胞（中國科學院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細胞庫）、miR-363抑制劑及陰性對照（上海吉瑪生物科技有限公司）、DMEM 培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司）、超級胎牛血清（武漢普諾賽生命科技有限公司）、胰酶（Gibco公司，美國）、Trizol ReagentRNA提取試劑盒（Invitrogen公司，美國）、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉錄試劑盒（大連TaKaRa公司）、UltraSYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒（寶生物工程大連有限公司）、miR-363和GADPH引物（大連TaKaRa公司）、四噻唑 藍 （methyl tihiazolyl tetrazolium，MTT， 美 國Amresco公司）、ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）、細胞蛋白抽提試劑（碧云天生物技術研究所）、鼠抗E2F3、抗Bax、抗Caspase-3單克隆抗體（Santa Cruz公司，型號為SC-526/HZ-4563R，美國）、辣根過氧化物酶HRP標記的親和純化山羊抗小鼠IgG、鼠抗GADPH單克隆抗體（武漢艾美捷科技有限公司）、CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo Revco，美國）、NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測儀（Thermo公司，美國）、實時熒光定量PCR分析儀和流式細胞儀（BIO-RAD公司，美國）、倒置顯微鏡（Nikon公司，日本）、BIO-RAD 垂直電泳儀（BD公司，美國）和HBS-1096B酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)和實驗分組 用含10%超級胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液37℃、5%CO2培養(yǎng)HepG2細胞，隔日換液。當細胞處于對數(shù)生長期時進行實驗。用Lipofectamine法將miR-363抑制劑或陰性對照轉染到HepG2細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收獲細胞，進行相關檢測。

1.3 HepG2細胞增殖檢測 采用MTT法，選擇對數(shù)生長期HepG2細胞，胰酶消化后調整細胞數(shù)，以5×103/孔接種于96孔板，200 μl/孔。各劑量組設3個平行孔，待細胞融合后，棄培養(yǎng)基，用miR-363抑制劑或陰性對照培養(yǎng)48 h，轉染到HepG2細胞。加入MTT 50 μl/孔，培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入DMSO 200 μl/孔，振蕩10 min，檢測吸光度值（OD值），計算HepG2細胞增殖率 [細胞增殖率=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）。

1.4 HepG2細胞凋亡檢測 使用流式細胞術檢測，按照1.2方法處理細胞，消化后按ANNEXIN VFITC/PI凋亡檢測試劑盒要求的方法測定HepG2細胞凋亡率。每孔5×105個細胞，各劑量組設3個平行孔。

1.5 HepG2細胞miR-363 mRNA水平檢測 采用實時熒光定量RT-PCR法檢測，按照1.2方法處理細胞，消化后取5 mL細胞液（細胞數(shù)為5×106/mL），5000 r/m離心5 min。根據(jù)RNA提取試劑盒操作說明書提取總RNA，測定mRNA濃度和純度。將提取的總RNA經(jīng)反轉錄，合成cDNA。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq TM II熒光定量PCR試劑盒說明，制備20 μl反應體系，在CFX-96 PCR擴增儀上擴增。反應條件為預變性95℃ 30 s、變性95℃ 5 s、60℃ 44 s，40個循環(huán)。采集數(shù)據(jù)，并對其水平進行分析。

1.6 HepG2細胞E2F3、Bax和Caspase-3蛋白水平檢測 采用Western Blot法檢測，按照1.2方法處理細胞，消化后，加無血清培養(yǎng)液2 ml，終止消化。5000 r/m 離心 5 min，洗滌 2 次，加入 PMSF 1 μl。根據(jù)細胞數(shù)，加入細胞蛋白抽提試液，冰浴2 h；4℃、10000 r/m離心15 min，取上清，進行蛋白定量；調整蛋白濃度，加入1/5體積的5×Buffer，沸水中變性，-80℃保存?zhèn)溆谩ｋ娪?、切膠；先后加一抗和二抗，孵育，采集圖像，對免疫印跡條帶灰度值進行分析。1.7統(tǒng)計分析 應用SPSS 19.0軟件錄入數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計學分析。計量資料以（±s）表示，經(jīng)方差齊性檢驗后，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 抑制miR-363對HepG2細胞增殖和凋亡的影響 與對照組比較，抑制劑組HepG2細胞增殖率降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表 1），HepG2細胞凋亡率增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1、圖 1）。

表1 兩組HepG2細胞增殖和凋亡（±s）比較

表1 兩組HepG2細胞增殖和凋亡（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05

孔數(shù) 細胞增殖（%） 細胞凋亡(%)對照組 3 96.4±9.7 8.1±1.4抑制劑 3 72.3±6.4① 9.7±0.8①

圖1 兩組HepG2凋亡率比較

2.2 兩組HepG2細胞miR-363 mRNA比較 與對照組比較，HepG2細胞總RNA水平無顯著變化（P＞0.05，表 2），而抑制劑處理組 HepG2細胞miR-363 mRNA相對水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表 2）。

表2 兩組HepG2細胞m iR-363 m RNA水平（±s）比較

表2 兩組HepG2細胞m iR-363 m RNA水平（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05

孔數(shù) 總RNA（ng/μl） miR-363對照組 3 35.1±5.7 1.0±0.1抑制劑 3 34.7±4.7 0.6±0.2①

2.3 兩組HepG2細胞E2F3、Bax和Caspase-3蛋白水平比較 與對照組比較，抑制劑處理組HepG2細胞E2F3蛋白表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表 3、圖 2），Bax蛋白和 Caspase-3 蛋白表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表3、圖2）。

表3 兩組HepG2細胞E2F3、Bax和Caspase-3蛋白表達水平（±s）比較

表3 兩組HepG2細胞E2F3、Bax和Caspase-3蛋白表達水平（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05

孔數(shù) E2F3對照組 3 0.9±0.1抑制劑 3 0.6±0.1①Bax 0.4±0.0 0.6±0.1①Caspase-3 0.5±0.1 0.7±0.0①

圖2 兩組HepG2細胞E2F3、BAX和Caspase-3蛋白表達變化

3 討論

HCC是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在惡性腫瘤中排第五位。在我國，PLC位于惡性腫瘤病死率的第二位，嚴重威脅到人類健康[11]。PLC復發(fā)是造成肝癌患者預后差、生存時間短的主要原因。腫瘤的復發(fā)涉及多因素和多個過程，其中miRNA的發(fā)現(xiàn)為腫瘤的防治研究提供了新的思路。miRNA是一種非編碼單鏈小分子RNA，能以堿基互補的形式結合到靶基因的非編碼區(qū)，結合到靶基因的3’-UTR區(qū)域，降解或者阻遏靶基因的翻譯和蛋白表達，從而對轉錄后基因進行負調控影響[12]。miRNA占人類基因數(shù)量的1%～3%，卻調控著超過30%的基因表達[13]。約有50%腫瘤的變異區(qū)域內可檢測到miRNA基因，且其結果具有可重復性，說明它們參與了多種細胞進程，如細胞增殖、分化、凋亡等，提示miRNA可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。在癌組織中，一些miRNA會特異地表達增高或降低，如 miRNA-155、miRNA-10b、miRNA-363和miRNA-21等常表達過度，而miRNA-214、miRNA-518b、miRNA-17p、miRNA-126、miRNA-335和 miRNA-205等則表達下調，從而促進腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移[14]。因此，miRNA在腫瘤的診斷、治療和預后評估等方面具有廣闊的應用前景。

miRNA-363在多種腫瘤中表達異常，通過調控不同的靶基因，從而調節(jié)細胞增殖和凋亡。miRNA-363通過鉚釘肝癌細胞Mcl-L區(qū)域而影響肝癌細胞的增殖[15]。在頭頸部鱗狀細胞癌細胞凋亡時，miRNA-363處于低表達狀態(tài)。同時，miRNA-363的表達降低可減弱神經(jīng)母細胞瘤細胞的侵襲和遷移能力[16]。E2F家族是最先在腺病毒E2基因中被發(fā)現(xiàn)，目前共發(fā)現(xiàn)了8個E2F成員。由于結構的差異，不同成員間功能也不盡相同[17]。E2F3參與細胞周期G1/S的調控和影響DNA的合成速度，與肝癌、乳腺癌和結腸癌等腫瘤的發(fā)生密切相關[18]。同時，E2F3還可以激活ARF基因，發(fā)揮原癌基因作用，對p53信號通路進行正調控，參與了細胞的增殖和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，E2F3在肝癌組織中高表達，使細胞周期在G1期停滯，促進了細胞凋亡[18]。Bax是Bcl-2家族中重要成員，Bax表達增加，使線粒體膜電位發(fā)生改變，使膜通道開放，將細胞色素C釋放到細胞質中，誘導凋亡小體形成，從而激活Caspase家族。Caspase家族是細胞凋亡執(zhí)行者。當Caspase被激活后，將引發(fā)Caspase級聯(lián)反應，凋亡啟動因子（Caspase-2、9等）發(fā)生活化并激活下游凋亡執(zhí)行因子（Caspase-3、6、7等），尤其是 Caspase-3的激活，表示細胞凋亡進入了不可逆階段，最終導致細胞進入凋亡階段[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，使用了miR-363抑制劑后，抑制劑處理組HepG2細胞miR-363 mRNA相對水平降低，進而調控E2F3的蛋白表達降低，使Bax和Caspase-3蛋白表達增加，抑制HepG2細胞增殖，并促進HepG2細胞凋亡。

綜上所述，miR-363可靶向調控E2F3的表達，使E2F3的表達降低，從而引起B(yǎng)ax和Caspase-3級聯(lián)化表達程序，抑制HepG2細胞增殖和誘導HepG2細胞凋亡，為 HCC的發(fā)生、發(fā)展機制和靶向治療提供了一定的理論依據(jù)。