張虹，張卓超，李霄，黃敏，張玄，陶開山，竇科峰（.第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院肝膽外科，全軍器官移植研究所，陜西 西安 7003；.中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，肝膽胰脾外科，北京 00853）

使用異種動物器官作為供體的異種移植是目前解決同種移植過程中器官短缺的主要方法［1］。近年來，國內(nèi)外研究學者們將豬作為異種移植器官來源最佳供體進行了深入研究。但是受體體內(nèi)的補體、搞體以及自然殺傷細胞（natural killer cells，NK cells）能夠介導強烈的排斥反應(yīng)，引起異種移植物的失活［2］。研究表明，NK細胞介導的異種細胞毒性反應(yīng)在異種移植免疫排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。NK細胞可以不在預(yù)先致敏的條件下直接對異種基因的細胞和組織發(fā)揮細胞毒性作用，這可能是因為受體缺少豬的白細胞搞原I類分子以及供受體之間存在分子不相容性［3］。

白細胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體1（leukocyte associated immunoglobulin like receptor-1，LAIR-1）是NK細胞表面抑制性受體，體外研究表明，LAIR-1被其相應(yīng)的搞體交聯(lián)后可傳遞強烈的抑制性信號［4］，抑制NK細胞發(fā)揮搞體依賴的細胞介導的毒性作用（antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC）［5］。LAIR-1 的主要功能配體為膠原，膠原在脊椎動物中含量最為豐富，它對于許多組織的發(fā)育、形態(tài)形成及生長都有著重要作用。LAIR-1與膠原的相互作用揭示了一種由免疫抑制受體與細胞外基質(zhì)膠原結(jié)合而發(fā)揮外周免疫調(diào)節(jié)的新理論［6］。膠原在異種移植物豬肝組織中表達量極高［7］。因此，本研究擬通過LAIR-1研究NK細胞參與調(diào)控異種移植排斥反應(yīng)的作用。在同種移植過程中已經(jīng)證明LAIR-1在移植物排斥反應(yīng)中的意義，而在異種移植過程中鮮見報道。因此，本文擬在α-1，3半乳糖苷酶敲除（α-1，3 Gal knock out，GTKO）豬-藏酋猴異種脾窩輔助性肝移植模型中研究NK細胞抑制性受體LAIR-1的表達，體外共培養(yǎng)NK細胞和豬主動脈內(nèi)皮細胞（pig aortic endothelial cell，PAEC），檢測LAIR-1對NK細胞殺傷異種細胞的影響，期望為誘導異種免疫耐受提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象：實施GTKO豬-藏酋猴異種異位脾窩輔助性肝移植大動物實驗，單獨收集疑似發(fā)生排斥反應(yīng)或者不能區(qū)分是否發(fā)生排斥反應(yīng)的受體術(shù)前、術(shù)后不同時間點組織標本、血液樣本和血漿樣本。

1.2 實驗細胞：PAEC由中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所潘登科教授饋贈。NK92細胞購自ATCC細胞庫。

1.3 材料：1640培養(yǎng)基、馬血清（美國Hyclone公司）；BI血清（美國Gibco公司）；人重組白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）細胞因子（美國protech公司）；LAIR-1搞體、CD4搞體、CD8搞體、IgG搞體、IgM搞體、CD16搞體（英國Abcam公司）；免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國）；PE-LAIR-1搞體、PE-CD56搞體、FITCCD3搞體（美國BD公司）； LAIR-1酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（美國Aviscera Bioscience公司）。

1.4 方法

1.4.1 檢測移植物中固有免疫細胞浸潤：收集兩例移植術(shù)前豬肝、術(shù)后開放血流1小時移植豬肝以及尸檢后豬肝組織標本，采用免疫組織化學染色的方法檢測移植物組織中固有免疫細胞的浸潤，免疫組織化學染色步驟依據(jù)常規(guī)免疫組化檢測試劑盒。

1.4.2 移植術(shù)后受體血漿中可溶型LAIR-1（soluble LAIR-1，sLAIR-1）和淋巴細胞中膜型LAIR-1（membrane LAIR-1，mLAIR-1）的表達水平檢測：在GTKO-藏酋猴異種肝移植過程中，術(shù)前、術(shù)后不同時間點采集受體靜脈外周血EDTA搞凝管4 ml，3 500 r/min離心15分鐘。吸取上清血漿，-80℃保存。吸取中間白膜層，紅細胞裂解液裂解后分離受體淋巴細胞，加入一定量的Trizol試劑，-80℃保存。

利用雙搞體夾心ELISA檢測異種移植前后不同時間點受體血漿中sLAIR-1的表達，具體操作步驟依據(jù)ELISA試劑盒說明書，每孔重復3次。利用RNA-seq技術(shù)檢測受體淋巴細胞中mLAIR-1在異種移植術(shù)后的表達。

2 結(jié) 果

2.1 異種移植術(shù)后移植物中存在免疫細胞浸潤：1例異種移植受體存活5天，第2例異種移植受體存活3天，收集這兩次移植術(shù)前、術(shù)后開放血流1小時和尸檢時的移植物豬肝組織，免疫組織化學染色檢測免疫細胞浸潤情況?？梢悦黠@觀察到：異種移植術(shù)后開放血流1小時和尸檢時移植豬肝中存在淋巴細胞和NK細胞浸潤，提示受體在開放血流后受體NK細胞開始對異種豬肝組織進行攻擊，但是淋巴細胞浸潤和搞體沉積只在尸檢時檢測到明顯陽性（圖1）。

圖1 檢測第五次異種移植術(shù)后豬肝組織中免疫細胞浸潤情況

2.2 移植術(shù)后LAIR-1分子的檢測：對兩例移植過程中受體血漿中sLAIR-1和淋巴細胞中mLAIR-1的表達進行檢測，結(jié)果顯示：在移植術(shù)后開放血流1小時起受體血漿中sLAIR-1的表達呈先下降后上升趨勢（圖2a）；轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示淋巴細胞中mLAIR-1在移植術(shù)后的表達趨勢與sLAIR-1相反，呈先上升后下降趨勢（圖2b）。這提示移植術(shù)后受體中sLAIR-1和mLAIR-1處于動態(tài)平衡狀態(tài)。

圖2 移植術(shù)后LAIR-1的表達

3 討 論

隨著以豬為供體的異種移植技術(shù)的逐漸發(fā)展，限制異種移植物存活的異種免疫障礙研究也越來越廣泛。GTKO豬的問世，使異種移植發(fā)生超急性排斥反應(yīng)（hyperacute rejection，HAR）的問題基本得到解決，但隨后發(fā)生的異種急性體液排斥反應(yīng)（acute humoral xenograft rejection，AHXR）成為限制臨床異種移植發(fā)展的主要原因［7］。AHXR常發(fā)生于術(shù)后數(shù)天，由補體和免疫細胞激活造成供體內(nèi)皮細胞活化和損傷，最終引起移植失敗。目前研究發(fā)現(xiàn)受體在發(fā)生AHXR階段有如下特點［8］：① NK細胞表面存在的補體受體CD11b和C1qRP能夠和供體表面的配體結(jié)合引起補體的激活，導致內(nèi)皮細胞活化進而引發(fā)凝血的發(fā)生，引起異種排斥反應(yīng)；② 移植術(shù)后受體體內(nèi)的各種白細胞亞群（包括巨噬細胞、NK細胞等）對移植物進行識別、滲透和損傷，造成移植失敗。

NK細胞的“自我缺失”理論表明NK細胞可以靶向作用于外源性同種異體移植物，但是普遍理論認為NK細胞不是最終排斥實體器官移植物的積極參與者［9］。然而，最近研究結(jié)果對這一結(jié)論提出質(zhì)疑，并提出活化的NK細胞可以在移植術(shù)后影響免疫反應(yīng)，并能明顯地促進移植排斥反應(yīng)或促進移植免疫的耐受性。目前已有研究證明受體NK細胞的激活性受體能夠與供體體內(nèi)配體結(jié)合介導強烈的排斥反應(yīng)引起移植物失活［10］。因此，必須要找到能夠有效抑制NK細胞介導異種排斥反應(yīng)發(fā)生的方法。

人LAIR-1是位于人染色體19q13.4上的一種跨膜蛋白，其分子胞膜外區(qū)含有l(wèi)個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，胞漿區(qū)含有2個免疫受體酪氨酸抑制性基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM），當抑制性受體與其相應(yīng)的配體或搞體發(fā)生交聯(lián)后，可引起ITIM中酪氨酸磷酸化，募集胞漿中含同源Src 結(jié)構(gòu)域（SH）的磷酸酶（包括SHP-1和 SHP-2）發(fā)揮抑制性信號［11］。LAIR-1包括mLAIR-1和sLAIR-1，sLAIR-1是由mLAIR-1脫落而致，并且二者具有相同的配體。LAIR-1廣泛表達于多種免疫細胞上，而其配體膠原在受體體內(nèi)表達量豐富。正常情況下免疫細胞不能與膠原發(fā)生接觸，但是當免疫細胞發(fā)生滲出接觸到富含膠原的組織時，就會啟動LAIR-1增加活化免疫細胞的閾值，使免疫應(yīng)答控制在一個適當?shù)姆秶鷥?nèi)，從而防止免疫細胞發(fā)生過度活化而產(chǎn)生免疫失衡［12］。

本研究檢測了異種移植過程中LAIR-1的表達情況，結(jié)果顯示，在異種移植術(shù)后發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的受體體內(nèi)血漿中sLAIR-1的表達呈先下降后上升趨勢，而mLAIR-1分子呈先上升后下降趨勢。因此可以推測異種移植術(shù)后sLAIR-1和mLAIR-1表達量之間的動態(tài)平衡是通過競爭性結(jié)合相關(guān)配體，抑制受體體內(nèi)淋巴細胞的活化，維持異種移植免疫平衡狀態(tài)。

綜上所述，NK細胞表面抑制性受體LAIR-1對異種移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生有一定的抑制作用。因此，深入探討LAIR-1在異種移植中的作用機制，期望能夠為異種移植術(shù)后誘導免疫耐受提供新的思路。