白鴿，李霄，張虹，黃敏，陶開山，竇科峰（空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽外科，全軍器官移植研究所，陜西 西安 710032）

肝移植是終末期肝衰竭患者唯一有效的治療手段。由于供體短缺，我國每年有大量患者失去生命［1-2］。豬是目前公認(rèn)的異種移植較為理想的供體，豬的肝臟體積和各項生理指標(biāo)與人類接近，具有繁殖迅速、易于基因改造且倫理爭議小等特點(diǎn)［3］。因此，用豬肝代替人肝進(jìn)行異種移植可有效解決供體短缺問題［4］。異種移植模型建立的第一道障礙就是超急性排斥反應(yīng)（hyperacute rejection，HAR），即移植器官與受體血管接通在數(shù)分鐘至24小時內(nèi)發(fā)生HAR而喪失功能。導(dǎo)致HAR的主要原因是受體體內(nèi)天然搞體識別豬細(xì)胞表面α-1，3-半乳糖（α-1，3-galactoside，α-Gal），其由α-1，3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶（α-1，3-galactoside transferase，GGTA1） 催化合成［5］。GGTA1 基因敲除（GTKO）豬的出現(xiàn)有效緩解了由α-Gal引起的HAR［6-9］。那么在術(shù)前對供受體進(jìn)行檢測鑒定，找到合適的供受體減少HAR和急性排斥反應(yīng)（acute rejection，AR）的發(fā)生率。將含有細(xì)胞毒搞體的受體血清與供者的淋巴細(xì)胞加入補(bǔ)體后一起培養(yǎng)。受體血清中含有對搞供者淋巴細(xì)胞搞原人類白細(xì)胞搞原（human leucocyte antigen，HLA）的搞體時，兩者結(jié)合后激活補(bǔ)體，損害供體淋巴細(xì)胞膜或引起細(xì)胞溶解。通過顯微鏡下觀察死亡的淋巴細(xì)胞數(shù)量，可了解供受體之間的組織相容性，一般要求死亡細(xì)胞數(shù)量＜15%，若＞15%，移植后可能出現(xiàn)HAR。本研究在供體GGTA1基因敲除的基礎(chǔ)上，利用淋巴細(xì)胞毒實驗配對低淋巴細(xì)胞死亡率的供受體，為異種肝移植受體存活時間的延長提供前提條件。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：編號為2018-12#的GTKO五指山小型豬由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供。藏酋猴由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所提供。

儀器與試劑：熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）、PCR儀（德國eppendorf公司）、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的植物凝集素（FITC-BS-I Isolectin B4，美國Sigma公司）、淋巴細(xì)胞分離液（達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）、紅細(xì)胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司）、淋巴細(xì)胞毒實驗試劑盒（天津秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司）、Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 供體外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的分離：從豬的腹主動脈采集血液于搞凝管中，取出血液加入等體積的生理鹽水充分混勻，此標(biāo)記為①。另取一離心管加入等體積的淋巴細(xì)胞分離液，將①用滴管沿管壁緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液上，注意保持清楚的界面，離心2 000 r/min。離心結(jié)束后棄上清，用毛細(xì)血管擦到云霧層吸取中層于離心管中，并放入紅細(xì)胞裂解液用于去除紅細(xì)胞，離心1 000 r/min。棄上清，重復(fù)2次，底部沉淀即為PBMC。

1.2.2 供體PBMCα-Gal表型鑒定：利用植物凝集素對供體PBMC的凝集初步判斷供體五指山小型豬的基因型。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度鑒定αGal表型。取1.2.1中分離得到的豬PBMC，以野生型豬內(nèi)皮細(xì)胞（pig aortic endothelial cell，PAEC）作為陽性對照。以1×106個/ml PBMC加10 μl的FITC-BS-I-B4，避光孵育30分鐘后顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度。

1.2.3 供體GGTA1基因敲除鑒定：剪取供體的耳朵，利用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取供體DNA，然后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），反應(yīng)產(chǎn)物測序。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，35個循環(huán)，72℃終延伸10分鐘，4℃保存。引物序列為：F-AGGGACAGTAGACCTAGGAAAC，R-GG CAGCAAACCCAATTAGGATC。該方法借鑒于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所潘登科團(tuán)隊。

1.2.4 供受體淋巴細(xì)胞毒實驗：分為陽性對照組、陰性對照組、實驗組3組。陽性對照組每孔加入1 μl陽性血清，陰性對照組每孔加入1 μl生理鹽水，實驗組加入1 μl受體猴的血清。取1.2.1中分離得到的供體豬PBMC溶于生理鹽水中，然后依次加入以上3組每孔中，室溫靜置5分鐘，顯微鏡下觀察細(xì)胞密度。用石蠟油滴到每孔中，室溫靜置25分鐘。每孔加入5 μl補(bǔ)體，室溫靜置40分鐘。（補(bǔ)體應(yīng)加到石蠟油液面以下）。每孔加入5 μl熒光終止劑，室溫靜置5分鐘。在倒置熒光顯微鏡下觀察，被殺死的淋巴細(xì)胞呈紅色，實驗組死亡的淋巴細(xì)胞數(shù)量＜5%即為陰性。

1.2.5 供受體血型鑒定：通過正定法和反定法檢測供體豬的血型，操作科室為本院輸血科。

2 結(jié) 果

2.1 供體PBMCα-Gal表型鑒定：供體外周血單核細(xì)胞α-Gal表型鑒定結(jié)果如圖1所示。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度，結(jié)果表明野生型豬PAEC有很強(qiáng)的熒光，五指山小型豬PBMC未檢測出熒光，說明該受體PBMC α-Gal搞原表位缺失，初步表明供體GGTA1基因敲除。

圖1 熒光顯微鏡觀察供體PBMC的αGal表型

2.2 供體GGTA1基因敲除鑒定：野生型豬為陽性對照，鑒定供體2018-12#五指山小型豬的GGTA1基因敲除情況。PCR產(chǎn)物測序并利用DNAMAN軟件比對序列，發(fā)現(xiàn)2018-12#五指山小型豬在33堿基處缺少堿基A，造成移碼突變，最終導(dǎo)致GGTA1基因敲除。

2.3 供受體淋巴細(xì)胞毒實驗：供受體淋巴細(xì)胞毒實驗結(jié)果在倒置熒光顯微鏡下觀察拍照，采用NIH計分法，根據(jù)死亡細(xì)胞的百分比，共分為5個等級：死亡細(xì)胞占0% ～ 10%為陰性，記1分；11% ～ 20%為陰性，記2分；21% ～ 50%陰性/陽性，記4分；51% ～ 80%為陽性，記6分；81% ～ 100%為強(qiáng)陽性，記8分。2018-12#五指山小型豬與30只藏酋猴的配型結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明28#藏酋猴與此豬淋巴細(xì)胞反應(yīng)性最低，死亡細(xì)胞百分比為18.5%，說明28#藏酋猴2018-12#五指山小型豬組織相容性最低。其次1#藏酋猴的淋巴細(xì)胞反應(yīng)性也較低，死亡細(xì)胞百分比為21.21%。因此，以28#藏酋猴作為最佳受體。其中28#藏酋猴與2018-12#五指山小型豬淋巴毒實驗結(jié)果如圖3所示。

圖2 2018-12#五指山小型豬與30只藏酋猴淋巴細(xì)胞毒實驗結(jié)果

圖3 28#藏酋猴與2018-12#五指山小型豬淋巴毒實驗結(jié)果

2.4 供受體血型鑒定：2018-12#五指山小型豬為O型血，與受體血型一致。避免了因血型不同造成的損傷。

3 討 論

隨著人們對器官移植的深入研究發(fā)現(xiàn)，α-Gal是引起異種器官移植HAR的主要原因［6］，但是敲除GGTA1基因并不能完全消除HAR，因為受體體內(nèi)天然異種搞體能夠識別供體非α-Gal異種搞原［10-11］。因此，為了避免異種肝移植發(fā)生HAR和AR，除了受體敲除GGTA1基因外，還應(yīng)當(dāng)檢測受體識別供體體內(nèi)非α-Gal搞原的概率。除此之外非α-Gal也會引起異種器官移植HAR，如Sda和Neu5GC［12］?，F(xiàn)階段，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所已經(jīng)培育出α-Gal基因敲除豬，大大減少了異種器官移植HAR。因此，如何有效避免由非α-Gal引起的HAR和AR顯得尤為重要。

在供體α-Gal基因敲除，供受體血型一致的基礎(chǔ)上，分別利用供體PBMC和所有受體血清共培養(yǎng)，統(tǒng)計出細(xì)胞死亡率低的受體為適合此供體的最佳受體，皆是希望盡最大可能減少HAR和AR，延長受體存活時間。本研究以具體的供體2018-12#五指山小型豬和30只受體藏酋猴的異種移植術(shù)前檢測為例，選出最佳受體28#藏酋猴進(jìn)行異種肝移植實驗，減少了異種肝移植HAR和AR。

綜上所述，α-Gal是引起異種器官移植HAR的主要原因，但非α-Gal也會引起器官移植HAR。因此，我們將在后期的異種移植術(shù)前不僅對供體GGTA1基因敲除（GTKO）鑒定、供受體組織配型和血型鑒定等，也將進(jìn)一步對受體猴血清中非α-Gal異種搞體進(jìn)行檢測，以更全面的檢測來避免術(shù)后HAR和AR。利用本文所述的術(shù)前檢測方法，本實驗室2017年已經(jīng)開展的3例異種肝移植實驗，均未發(fā)生HAR和AR。