李霄，紀(jì)洪辰，潘登科，周亮，竇科峰，陶開(kāi)山（. 空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽外科，陜西 西安 700；. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 009；. 四川省人民醫(yī)院·四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，四川 成都 6007）

肝移植是終末期肝病所致肝功能衰竭的唯一治愈方法［1］。臨床同種肝移植技術(shù)已成熟，全球多個(gè)移植中心報(bào)道受體5年存活率可達(dá)70% ～ 80%，但同種供體短缺卻嚴(yán)重限制了肝移植的臨床應(yīng)用［2］，致使絕大多數(shù)患者因得不到合適的供肝而死亡。因此，開(kāi)展異種移植研究，以動(dòng)物器官橋接或代替人類器官進(jìn)行移植，是解決供體短缺的重要途徑［3］。但異種肝移植目前仍然面臨凝血功能障礙、急性排斥反應(yīng)等諸多問(wèn)題，最長(zhǎng)存活時(shí)間不到1個(gè)月［4-7］。而這些問(wèn)題的核心在于異種移植后供肝相關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)的變化［8］。但這一方面的研究仍然處于初級(jí)階段，尚無(wú)系統(tǒng)性的高通量基因比較篩選哪些是異種移植術(shù)后表達(dá)變化較大的關(guān)鍵基因。因此，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)異種肝移植手術(shù)前后移植肝標(biāo)本進(jìn)行微小核糖核酸（microRNA，miRNAs）和mRNAs 的差異篩選，以期找到異種肝移植術(shù)后變化的關(guān)鍵基因，為異種肝移植術(shù)后搞免疫排斥反應(yīng)和搞凝血功能障礙提供新靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 異種肝移植模型的構(gòu)建

供體情況：以中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所培育的α-1，3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶（α-1，3-galactosy transferase，GGTA1）基因敲除（GTKO）五指山小型豬為供體，共4只，體重6 ～ 8 kg，均為雄性，3 月齡，血型A 型。

1.1.2 受體信息：以四川省人民醫(yī)院·四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所飼養(yǎng)的藏酋猴為受體，共 4 只，體重 16 ～ 18 kg，均為雄性，10 ～ 12 歲，血型O 型。

1.1.3 手術(shù)方式：應(yīng)用本單位前期創(chuàng)建的脾窩異位輔助性肝移植術(shù)式，建立異種異位輔助性肝移植模型。手術(shù)過(guò)程簡(jiǎn)述如下：供、受體常規(guī)氣管插管麻醉，取仰臥位，固定四肢。原位切取部分GTKO豬的肝臟，離體修整。切除受體脾臟，將供肝置入脾窩。將供肝肝動(dòng)脈與受體脾動(dòng)脈吻合，供肝門靜脈與受體左腎靜脈吻合，供肝肝靜脈與受體下腔靜脈吻合，重建出入肝血流。將移植肝膽管插管并引出體外。標(biāo)本獲?。河诠└涡拚麜r(shí)切取適量供肝組織，此為移植術(shù)前標(biāo)本。于移植肝開(kāi)放血流后48小時(shí)以肝穿刺活檢獲得移植肝標(biāo)本，此為移植術(shù)后標(biāo)本。將上述標(biāo)本分別保存于液氮中備用。

1.2 miRNAs芯片及mRNAs芯片檢測(cè)：將手術(shù)前后的組織標(biāo)本，送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)公司，應(yīng)用 Exiqon miRNA芯片（Exiqon，Benmark）以及Agilent 4×44K豬全基因芯片（美國(guó)Agilent公司）進(jìn)行檢測(cè)。分析結(jié)果使用SAM 3.0 分析軟件進(jìn)行差異表達(dá)miRNAs及mRNAs的分析篩選。以上調(diào)或下調(diào)2.0倍為閾值，篩選異種移植術(shù)后移植肝表達(dá)差異較大的基因。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)：將待檢測(cè)組織標(biāo)本研碎，1 ml Trizol 裂解5分鐘，加入200 μl氯仿，迅速震蕩后室溫靜止5分鐘，而后以12 000 r/min速度離心15分鐘；吸取400 μl 上清液，加入400 μl異丙醇，混勻后在4 ℃ 環(huán)境下靜置5分鐘，而后以12 000 r/min 速度離心15分鐘。棄上清，以無(wú)RNA酶水溶解RNA 沉淀，測(cè)定A260/A280 的比值。得到RNA 后，使用Takara 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物工程有限公司，中國(guó)大連）進(jìn)行cDNA 合成。按照Takara qPCR 試劑盒（寶生物工程有限公司，中國(guó)大連）說(shuō)明書操作。以無(wú)RNAase 水將cDNA 稀釋10倍。PCR 反應(yīng)體系：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5 μl，目的基因正義鏈引物1 μl，目的基因反義鏈引物 1 μl，cDNA 模板 2 μl，無(wú) RNAase 水 8.5 μl，總反應(yīng)體系為25 μl。IQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio-Rad，American）進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件設(shè)定如下：95 ℃預(yù)變性3分鐘，95 ℃變性5秒，59 ℃退火延伸40秒，共設(shè)40 個(gè)循環(huán)。

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot）檢測(cè)：使用Trizol 裂解組織標(biāo)本后，加入6×SDS Sample Buffer，99 ℃加熱5分鐘，冷卻后以20 000 r/min速度離心3分鐘。隨后將20 μl 樣品加入SDSPAGE 凝膠，電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，使用TBS 緩沖液在室溫下洗膜5分鐘。洗膜完成后，將膜在25 μl 封閉緩沖液中室溫封閉1小時(shí)，用TBST 緩沖液震蕩洗滌5分鐘，重復(fù)以上操作3 次。使用 1：1 000 稀釋的anti-IGFBP6、anti-CDK2AP1、anti-TNFAIP6、anti-FⅦ 或 anti-NKG2D 的單克隆搞體（美國(guó)Abcam公司）覆蓋薄膜，置于4 ℃ 搖床孵育過(guò)夜。使用15 ml TBST 緩沖液膜3 次，每次5小時(shí)。隨后，將膜與10 ml 稀釋的Dyelight 645 熒光染料藕聯(lián)的二搞室溫孵育1小時(shí)，在搖床上輕輕搖動(dòng)。使用15 ml TBST 緩沖液洗3 次，每次5分鐘。將熒光發(fā)光劑以1：1 的比例混合后，在Typhoon 8600 多功能成像儀（美國(guó)Amersham公司）中掃描成像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS 19.0軟件（IBM）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用兩樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析方法進(jìn)行分析，以P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 移植肝手術(shù)前后差異表達(dá)的miRNAs：應(yīng)用Exiqon miRNA芯片，對(duì)手術(shù)前后的移植肝組織進(jìn)行檢測(cè)，獲得miRNAs雜交圖譜（圖1）。以上調(diào)或下調(diào)2倍作為篩選閾值進(jìn)行分析，以確定失調(diào)結(jié)果的有效性。結(jié)果顯示，與術(shù)前相比，有165個(gè)miRNAs 在術(shù)后出現(xiàn)差異表達(dá)，其中上調(diào)分子112個(gè)，下調(diào)分子53個(gè)（圖2）。進(jìn)一步應(yīng)用INDepth分析篩選出mi-23b等12個(gè)在異種肝移植術(shù)后出現(xiàn)顯著差異的miRNAs（表1），并對(duì)這些miRNAs 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)驗(yàn)證。結(jié)果表明，除miR-150和miR-126-3p外，其他miRNAs的表達(dá)變化情況與miRNAs芯片結(jié)果基本相符，篩選結(jié)果可信度較高（圖3）。

圖1 miRNAs芯片結(jié)果

圖2 手術(shù)前后移植肝組織內(nèi)miRNAs 差異表達(dá)分析

表1 差異miRNAs 分子情況

圖3 實(shí)時(shí)定量PCR 驗(yàn)證篩選出的miRNAs

圖4 移植肝差異基因表達(dá)譜

2.2 移植肝手術(shù)前后mRNAs變化情況：應(yīng)用Agilent 4×44K豬全mRNAs芯片對(duì)手術(shù)前后的移植肝組織進(jìn)行高通量篩選檢測(cè)，同樣選擇上調(diào)或下調(diào)2 倍作為篩選的閾值。結(jié)果顯示：與術(shù)前相比，有2 035個(gè)mRNAs 在術(shù)后出現(xiàn)顯著差異表達(dá)，其中922個(gè)表達(dá)上調(diào)、1 113個(gè)表達(dá)下調(diào)（圖4）。在這些mRNAs中，篩選出與器官移植密切相關(guān)且差異較大的基因共117個(gè)，包括免疫排斥相關(guān)基因20 個(gè)，炎癥相關(guān)基因6個(gè)，創(chuàng)傷應(yīng)激相關(guān)基因12個(gè)，固有免疫應(yīng)答相關(guān)基因22個(gè)，細(xì)胞黏附相關(guān)基因25個(gè)，凋亡相關(guān)基因23個(gè)，氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因9個(gè)。

2.3 術(shù)后差異表達(dá)顯著基因的驗(yàn)證：綜合mRNAs篩選的結(jié)果，從不同類型的基因中篩選出胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白6（insulin like growth factor binding protein-6，IGFBP6）、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2-相關(guān)蛋白1（cyclin-dependent kinase 2 associated protein 1，CDK2AP1）、腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白 6（tumor necrosis factor-inducible protein 6，TNFAIP6）、凝血因子Ⅶ（coagulation factorⅦ，F(xiàn)Ⅶ）、自然殺傷細(xì)胞表面活化性受體D（natural-killer group 2，member D，NKG2D）等 5個(gè)生物學(xué)功能可能與肝臟移植密切相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行組織水平驗(yàn)證。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，5個(gè)基因的mRNA 表達(dá)在術(shù)后均出現(xiàn)較大幅度變化，其中IGFBP6、CDK2AP1分別下調(diào)（5.9±0.5）倍、（3.8±0.2）倍，TNFAIP6、FⅦ、NKG2D 分別上調(diào)（8.6±0.7）倍、（11.8±1.1）倍、（6.4±0.4）倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.015、0.031、0.007、0.001、0.004）（圖5a）。檢測(cè)結(jié)果與芯片檢測(cè)結(jié)果一致。進(jìn)一步Western Blot實(shí)驗(yàn)分析表明，與術(shù)前相比，術(shù)后IGFBP6蛋白、NKG2D蛋白與CDK2AP1 蛋白分別下調(diào)（4.42±0.96）倍、（2.55±0.73）倍、（1.06±0.14）倍（P＝ 0.028、0.039、0.073），TNFAIP6蛋白與FⅦ蛋白分別上調(diào)（2.35±0.66）倍、（1.49±0.52）倍（P ＝0.030、0.045）。除NKG2D 外，其他4 個(gè)基因的蛋白水平表達(dá)變化與mRNA水平變化基本一致，但CDK2AP1 的蛋白變化幅度較小，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖5b、5c）。

圖5 移植肝差異基因在組織水平中的驗(yàn)證

3 討 論

解決異種肝移植所存在問(wèn)題的關(guān)鍵，在于對(duì)異種移植術(shù)后發(fā)生變化的關(guān)鍵基因做出針對(duì)性的干預(yù)［9］。異種移植術(shù)后的基因變化是一個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程，即使和同種移植術(shù)后出現(xiàn)類似的病理變化，其機(jī)制也存在非常大的區(qū)別。例如，在凝血功能障礙方面，Ekser［10］、Lin［11］及 Ji［12］等發(fā)現(xiàn)，異種移植術(shù)后凝血功能障礙的發(fā)生并非源于免疫損傷導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞激活，其凝血功能障礙的發(fā)生機(jī)制與經(jīng)典的凝血功能障礙發(fā)生機(jī)制存在較大的區(qū)別。而在免疫排斥反應(yīng)方面，異種急性免疫排斥反應(yīng)的主要機(jī)制是受體固有免疫系統(tǒng)的激活，導(dǎo)致固有免疫細(xì)胞對(duì)異種移植物的免疫損傷與吞噬，這也不同于同種移植中以細(xì)胞和體液免疫為主的適應(yīng)性免疫排斥反應(yīng)［13-15］。

為找到異種移植術(shù)后發(fā)生變化的關(guān)鍵基因，本研究對(duì)異種肝移植手術(shù)前后的移植肝標(biāo)本進(jìn)行了高通量的miRNAs 和mRNAs 篩選。miRNAs的作用在于調(diào)控真核基因的表達(dá)。因此，對(duì)miRNAs的篩選可為差異mRNAs 的篩選提供更有力的理論支持，也可以在篩選出差異mRNAs后提供潛在的有效的調(diào)控手段。結(jié)果發(fā)現(xiàn)mi-23b等12個(gè)在異種移植術(shù)后表達(dá)差異較大的miRNAs。隨后在對(duì)差異mRNAs 的篩選中，找到922個(gè)表達(dá)上調(diào)和1 113 個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因。為確認(rèn)這些基因在異種移植術(shù)后的變化情況，根據(jù)其生物學(xué)功能，篩選出IGFBP6等6個(gè)潛在的異種移植術(shù)后變化的關(guān)鍵基因，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證檢測(cè)。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果與芯片檢測(cè)的結(jié)果基本一致。而Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)除NKG2D蛋白外，其他分子蛋白的變化與實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)結(jié)果基本一致。

IGFBPs 是一組具有同源結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、黏附、凋亡、血管生成、腫瘤發(fā)生等多種功能，而IGFBP6是其主要組成蛋白。IGFBPs 通過(guò)與胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin like growth factor，IGF）的結(jié)合，調(diào)控IGF的活性，從而維持和控制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、成熟和再生等生理過(guò)程。CDK2AP1 是細(xì)胞周期調(diào)控中的重要因子，和周期蛋白協(xié)同作用，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡中發(fā)揮重要調(diào)控作用。TNFAIP6 是功能明確的凋亡調(diào)控蛋白之一，對(duì)免疫細(xì)胞凋亡具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，在CD4+CD8+T細(xì)胞中表達(dá)水平明顯上調(diào)，對(duì)胸腺細(xì)胞凋亡發(fā)揮關(guān)鍵作用。移植術(shù)后TNF AIP6顯著上調(diào)提示其對(duì)移植免疫排斥具有正向促進(jìn)作用。FⅦ是外源性凝血途徑的重要凝血因子，與組織因子（FⅢ）結(jié)合后迅速激活FX，最終導(dǎo)致凝血酶原激活引發(fā)凝血。其術(shù)后上調(diào)符合異種肝移植術(shù)后受體的凝血功能變化的病理生理過(guò)程。當(dāng)然，這些蛋白的具體功能還有待下一步的干預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

總之，本研究利用高通量芯片分析技術(shù)，篩選出可能的關(guān)鍵基因，并在mRNA和蛋白質(zhì)水平分別對(duì)其變化情況進(jìn)行了驗(yàn)證，為明確異種移植免疫排斥反應(yīng)和凝血功能障礙的發(fā)生機(jī)制提供部分實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究的不足在于尚未對(duì)篩選出的關(guān)鍵基因的功能及變化機(jī)制進(jìn)行干預(yù)驗(yàn)證，而這也是本研究下一步的工作重點(diǎn)。